소 난소 피질 조직 배양
Summary
소 난소 피질의 체외 문화와 난소 미세 환경에 대한 영양 계단 단계 식단의 효과가 제시됩니다. 난소 피질 조각7 일 동안 배양 하 고 스테로이드, 사이토 카인, 그리고 여포 단계 평가 되었다. 계단 단계 다이어트 치료는 문화에서 여포 진행의 결과로 증가 스테로이드 발생했다.
Abstract
초보에서 antral 단계로의 여포 발달은 체세포 및 적혈구 세포-oocyte 통신에서 내분비 및 파라크리인을 포함하는 난소 피질 내의 동적 과정입니다. 난소 미세 환경과 주변 밀리에서 생산 된 사이토카인과 스테로이드가 여포 진행 또는 체포에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려져 있습니다. 난소 피질의 체외 배양은 여포가 인접한 스트로마에 의해 지원되는 정규화된 환경에서 발전할 수 있게 합니다. 우리의 목표는 소난소 피질의 체외 문화를 통해 난소 미세 환경 (여포 발달, 스테로이드 및 사이토카인 생산)에 영양 계단 단계 식단의 효과를 결정하는 것이었습니다. 이를 위해 난소 피질 조각은 사춘기 이전에 두 가지 영양학적으로 개발된 두 가지 영양학적 개발 체계를 겪고 있는 하이퍼에서 제거되었습니다: 제어(전통적인 영양 발달) 및 Stair-Step(개발 중 의 먹이 주기 및 제한) 약 0.5-1mm3개로 절단되었습니다. 이 조각들은 이후 일련의 세차를 통과하고 웨이머스의 배양 배지를 잘 포함하는 조직 배양 삽입에 배치되었다. 난소 피질은 매일 문화 매체의 변화와 함께 7 일 동안 배양되었다. 조직학적 단면은 추가 치료 없이 영양의 영향과 문화의 영향을 결정하기 위해 문화 전후의 여포 단계 변화를 결정하기 위해 수행되었다. 피질 배양 배지 스테로이드를 측정 하기 위해 일 동안 풀링 되었다, 스테로이드 대사 산물, 그리고 사이토 카인. 난소 미세 환경에서 증가 된 스테로이드 호르몬에 대 한 경향이 있었다 제어 난소 피 질 배양 대 계단 에서 여포 진행을 허용. 난소 피질 배양 기술은 난소 미세 환경의 더 나은 이해를 허용하고, 내분비 분비의 변경이 생체 및 체외 치료 모두에서 여포 진행과 성장에 영향을 미칠 수있는 방법. 이 문화 방법은 또한 비옥을 승진시키기 위하여 여자에 있는 여포 진행을 향상할 수 있는 잠재적인 치료시험을 위한 유익한 증명할 수 있습니다.
Introduction
난소 피질은 여포 발달이 발생하는 난소의 외부 층을 나타냅니다1. 처음에 개발에서 체포 된 원시 여포는 파라크리네 및 생식샘 호르몬 입력1,2,3,4에기초한 원차, 보조 및 다음 항제 또는 삼차 여포로 활성화됩니다. 난소 내의 생리적 과정을 더 잘 이해하기 위해 조직 배양은 체외 모델로 사용될 수 있으므로 조절된 환경이 실험을 수행할 수 있습니다. 많은 연구가 보조 생식 기술, 불임 보존 및 난소암5,6,7의연구를 위해 난소 조직 문화를이용했습니다. 난소 조직 배양은 또한 난소 건강을 손상시키는 생식 독소를 조사하는 모델로 사용되었으며 다낭성 난소 증후군 (PCOS)8,9,10,11과같은 생식 장애의 병인. 따라서 이 문화 시스템은 다양한 특산품에 적용할 수 있습니다.
설치류에서, 전체 태아 또는 주산기 생식기 생식 실험에 사용 되었습니다12,13,14,15. 그러나, 큰 국내 가축에서 gonads그들의 큰 크기와 잠재적인 변성 때문에 전체 기관으로 배양 될 수 없습니다. 따라서, 소, 및 비인간 영장류 난소 피질은 작은조각으로 절단된다 16,17,18. 많은 연구는 국내 가축및 비인간 영장류에서 원시 여포 개시에서 다양한 성장 인자를 연구하기 위해 작은 난소 피질 조각을배양1,17,18,19. 난소 피질 문화의 사용은 또한 7 일20동안 배양 된 소와 영장류 피질 조각에 대한 혈청이 없는 상태에서 원시 여포 개시를 입증했다. 양과 포춘은 2006년 10일 이상 다양한 테스토스테론 투여량으로 태아 난소 피질 배양 배지를 치료하고,10-7M 의 테스토스테론 농도가 여포 모집, 생존, 초기 단계 여포의 진행 증가등을 관찰하였다 19. 2007년, 소 태아(임신 5-8개월)로부터 난소 피질 배양을 사용하여 양과 포춘은 1차에서 이차 여포전환(21)에혈관 내피 성장 인자 A(VEGFA)의 역할을 보고했다. 더욱이, 당사의 실험실은 VEGFA가16을결합하는 주요 신호 전달 수용체인 키나제 도메인 수용체(KDR)를 통해 VEGFA 이소형성(혈관형성, 항혈관형성 및 조합)이 어떻게 다른 신호 전달 경로를 조절할 수 있는지 를 보여주기 위해 난소 피질 배양을 활용하였다. 이 정보는 다른 VEGFA 동소 형태가 여포 진행 또는 체포를 유도하는 신호 경로에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수 있었습니다. 함께 촬영, 다른 스테로이드 또는 성장 인자와 체외에서 난소 피질 조각의 배양 여 포 여 추 신을 조절 하는 메커니즘에 미치는 영향을 결정 하는 귀중 한 분석 될 수 있습니다. 유사하게, 다른 영양 정권에 개발되는 동물은 여성 생식 성숙에 영향을 미치는 여포 발생을 촉진하거나 억제 할 수있는 난소 미세 환경을 변경했을 수 있습니다. 따라서, 현재 원고에서 우리의 목표는 소 피질 배양 기술을 보고하고이전에설명된 바와 같이 13개월에 수집된 암소 피질로부터 소 피질의 체외 배양 후 난소 미세환경에 차이가 있는지 여부를 결정하는 것입니다.
따라서, 우리의 다음 단계는 다른 영양 식단으로 개발 된 이 암소에서 난소 미세 환경을 결정하는 것이었습니다. 우리는 계단 단계 또는 제어 규정식으로 공급된 암낭에서 난소 피질을 평가했습니다. 제어 용 heifers는 84 일 동안 97.9 g / kg0.75의 유지 보수 식단을 제공받았다. Stair-Step 규정식은 84 일 동안 67.4 g/kg0.75의 제한된 규정식을 포함하는 8 달에 시작되었습니다. 처음 84일 후, 컨트롤 하이퍼는 97.9 g/kg0.75를계속 받았지만, 계단-스텝 쇠고기 하이퍼는 68일 동안 118.9g/kg0.75를 제공받았으며, 그 후16세의 13개월 동안 모낭 단계와 모폴로지의 변화를 연구하기 위해 16세에 소독화되었다. 우리는 또한 스테로이드에 차이 대 한 분석, 스테로이드 대사 산물, chemokines, 그리고 시토 카인 피 질 매체로 분 비. 스테로이드와 다른 대사 산물 생체 내에서 실시 하는 치료에서 어떤 직접적인 효과 있는지 확인 하기 위해 측정 되었다 및/또는 조직 생존 및 생산성에 시험관 내. 문화 이전과 후 난소 미세 환경의 변화는 문화 전에 내분비 밀리우와 여포 발생의 스냅 샷을 제공하고 문화 동안 문화 또는 치료가 여포 진행 또는 체포에 미치는 영향.
난소는 미국에서 혈관 절제술이 수행 된 후 수집되었다. 육류 동물 연구 센터 (USMARC)는16세의 13 개월에 제어 및 계단 – 스텝 암종의 IACUC 절차에 따라, 혈액 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 0.1 %의 항생제로 세척, 초과 조직을 손질하고 네브래스카 – (UNL 생식 의학) 3°C로 수송 . UNL에서 난소 피질 조각은 작은 사각형 조각으로 절단되었습니다 (~ 0.5-1 mm3; 그림 1) 7 일 동안 배양(그림 2). 조직학은 모낭 단계16,24 (도 3 및 도 4)및 섬유증을 나타낼 수 있는 세포외 매트릭스 단백질(Picro-Sirus Red, PSR; 그림 5). 이것은 여포 단계에 생체 내 영양 정권의 효력의 결정을 허용하고 여포 단계 및 여포 진행에 난소 피질의 7 일 비교를 허용했습니다. 배양 전반에 걸쳐, 배지는 매일 수집 및 변경되었습니다 (약 70%의 미디어가 매일 수집되었다; 250 μL/well) 그래서 매일 호르몬/사이토카인/케모킨을 평가하거나 평균 농도를 얻기 위하여 며칠 동안 풀로 울 수 있습니다. 안드로스텐디온(A4) 및 에스트로겐(E2)과 같은 스테로이드는 3일 이상 풀려나 방사선 면역분석술(RIA;; 그림 6) 및 동물 당 4 일 이상 풀및 고성능 액체 크로마토그래피 질량 분광법 (HPLC-MS)24,25 (표 1)를통해 분석. 사이토카인 어레이는 난소 피질 배양배지(26)에서 사이토카인 및 체모킨 농도를 평가하기 위해 활용되었다(표 2). 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석 플레이트는 이전에16회입증된 바와 같이 특정 신호 트랜스듀션 경로에 대한 유전자 발현을 결정하기 위해 수행되었다. 모든 스테로이드, 사이토카인, 여포 단계 및 조직학적 마커는 난소 미세 환경의 스냅샷과 “정상” 또는 “비정상적인” 여포 발생을 촉진하는 마이크로 환경의 능력에 대한 단서를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에 설명된 바와 같이 체외 난소 피질 문화의 장점은 여포를 둘러싼 인접한 기질이 있는 정상화된 환경에서 여포가 발전한다는 것입니다. 체세포 및 난소세포는 그대로 유지되며 생체 내 모델으로서 적절한 세포 간 통신이 있다. 우리의 실험실은 7 일 문화 시스템이 난소 피질의 처리를 위한 대표적인 여포 신생 및 스테로이드 발생 데이터를 제공한다는 것을 것을을 발견했습니다. 다른 난?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 ASC에 국립 식품 농업 연구소에 의해 지원 되었다 2013-67015-20965 ASC에, 건강 경쟁 보조금에 대 한 네브래스카 식품 대학. 미국 농무부 보조금 NEB26-202/W3112 가입 #1011127 ASC, 해치-NEB ANHL 가입 #1002234 ASC에. 양적 생명 과학 이니셔티브 여름 박사 후 학자 지원 – CMS에 대한 여름 자금에 대한 COVID-19 상.
저자는 로버트 쿠시먼 박사, 미국 육류 동물 연구 센터, 클레이 센터, NE박사에게 감사를 표하고 싶습니다 이전 출판물에서 난소를 제공 한 그에게 감사, 이는 다음이 기술을 검증하는 개념의 증거로 현재 논문에 사용된.
Materials
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
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