लाइव माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के तहत 3डी हाइड्रोगेल का नियंत्रित तनाव
Summary
प्रस्तुत विधि में सिलिकॉन रबर में एम्बेडेड 3 डी सॉफ्ट हाइड्रोगेल का एकीय खींच शामिल है, जबकि लाइव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की अनुमति देता है। बाहरी और आंतरिक हाइड्रोगेल उपभेदों के साथ-साथ फाइबर संरेखण का लक्षण वर्णन किया जाता है। विकसित डिवाइस और प्रोटोकॉल विभिन्न तनाव व्यवस्थाओं के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का आकलन कर सकते हैं।
Abstract
बाहरी ताकतें ऊतक निर्माण, विकास और रखरखाव में एक महत्वपूर्ण कारक हैं। इन ताकतों के प्रभावों का अक्सर विशेष इन विट्रो स्ट्रेचिंग विधियों का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है। विभिन्न उपलब्ध प्रणालियां 2डी सब्सट्रेट-आधारित स्ट्रेचर का उपयोग करती हैं, जबकि सॉफ्ट हाइड्रोगेल्स को तनाव देने के लिए 3डी तकनीकों की पहुंच अधिक प्रतिबंधित है। यहां, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो नमूना वाहक के रूप में लोचदार सिलिकॉन स्ट्रिप का उपयोग करके, उनकी परिधि से नरम हाइड्रोगेल के बाहरी खींच की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली स्ट्रेचिंग सिस्टम का निर्माण 3डी-मुद्रित भागों और कम लागत वाले इलेक्ट्रॉनिक्स से किया जाता है, जिससे अन्य प्रयोगशालाओं में इसे सरल और आसान बनाया जाता है। प्रायोगिक प्रक्रिया सिलिकॉन स्ट्रिप के केंद्र में कट-आउट में पॉलीमराइजिंग मोटी (>100 माइक्रोन) सॉफ्ट फिब्रिन हाइड्रोगेल्स (~ 100 पीए के लोचदार मोडुलस) के साथ शुरू होती है। सिलिकॉन-जेल निर्माण तब मुद्रित-खींच डिवाइस से जुड़े होते हैं और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चरण पर रखे जाते हैं। लाइव माइक्रोस्कोपी के तहत स्ट्रेचिंग डिवाइस सक्रिय होता है, और जैल को विभिन्न खिंचाव परिमाण पर चित्रित किया जाता है। छवि प्रसंस्करण का उपयोग तब जेल की 3 डी मोटाई(जेड-एक्सिस)में अपेक्षाकृत समरूप उपभेदों और फाइबर संरेखण का प्रदर्शन करते हुए परिणामी जेल विरूपण की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इस विधि के फायदों में सीटू माइक्रोस्कोपी में निष्पादित करते समय 3 डी में बेहद नरम हाइड्रोगेल को तनाव देने की क्षमता और उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार नमूने की ज्यामिति और आकार में हेरफेर करने की स्वतंत्रता शामिल है। इसके अतिरिक्त, उचित अनुकूलन के साथ, इस विधि का उपयोग अन्य प्रकार के हाइड्रोगेल (जैसे, कोलेजन, पॉलीएक्रिलीन ग्लाइकोल) को फैलाने के लिए किया जा सकता है और अधिक बायोमिमेटिक 3 डी स्थितियों के तहत बाहरी ताकतों के लिए कोशिकाओं और ऊतक प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है।
Introduction
यांत्रिक बलों के ऊतक प्रतिक्रिया जीन अभिव्यक्ति1,कोशिका भेदभाव2,और ऊतक रीमॉडलिंग3सहित जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला का एक अभिन्न हिस्सा है। इसके अलावा, फाइबर संरेखण और डेन्सिफिकेशन जैसे एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में बल-प्रेरित परिवर्तन सेल व्यवहार और ऊतक निर्माण4,5,6को प्रभावित कर सकते हैं। ईसीएम की रेशेदार जाल संरचना में गैर-रैखिक लोच, गैर-एफ़िन विरूपण और प्लास्टिक विरूपण7,8,9,10, 11,12जैसे पेचीदा यांत्रिक गुण हैं। ये गुण इस बात पर प्रभाव डालते हैं कि कोशिकाएं और उनके आसपास के सूक्ष्म पर्यावरण बाहरी यांत्रिक बलों का जवाब कैसे देते हैं13,14. यह समझना कि ईसीएम और ऊतक यांत्रिक बलों का जवाब कैसे देते हैं, ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में और अधिक सटीक कंप्यूटेशनल और सैद्धांतिक मॉडल के विकास में प्रगति को सक्षम करेगा।
यांत्रिक रूप से नमूनों को फैलाने के लिए सबसे आम तरीकों ने सेल-लादेन 2डी सब्सट्रेट्स पर ध्यान केंद्रित किया है ताकि सेल व्यवहार पर प्रभाव का पता लगाया जा सके। इनमें, उदाहरण के लिए, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) सब्सट्रेट्स पर दबाव लगाना और खिंचाव दिशा15, 16, 17,18,19के संबंध में सेल रीओरिएटिंग कोणों का विश्लेषण करना शामिल है। फिर भी, बाहरी खिंचाव के लिए 3 डी सेल एम्बेडेड हाइड्रोगेल की प्रतिक्रिया की जांच करने वाले तरीके, एक ऐसी स्थिति जो ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट की अधिक बारीकी से नकल करती है, अधिक सीमित हैं। 3डी स्ट्रेचिंग विधियों की ओर प्रगति का विशेष महत्व है क्योंकि 3डी मैट्रिस 20 की तुलना में कोशिकाएं2डीसब्सट्रेट्स पर अलग व्यवहार करती हैं। इन व्यवहारों में सेलुलर पुनर्संरेखण, प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर, और माइग्रेशन पैटर्न21,22,23शामिल हैं।
3डी सैंपल खींचने की अनुमति देने वाले तरीकों और उपकरणों में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध24 , 25,26,27,28और प्रयोगशाला अनुसंधान29 के लिए विकसित किए गए दोनों शामिल हैं । इन तरीकों में डिस्टेंसिबल सिलिकॉन ट्यूब30, मल्टी-वेल चैम्बर्स31, क्लैंप26,32, बायोरिएक्टर11,33,कैंटिलीवर्स34,35,36और मैग्नेट37,38का उपयोग करते हैं । कुछ तकनीकें ऐसे खिंचाव उत्पन्न करती हैं जो स्थानीय रूप से 3 डी हाइड्रोगेल को विकृत करती है, उदाहरण के लिए जेल5में दो एकल बिंदुओं से सुई खींचकर, जबकि अन्य जेल16के पूरे थोक के विरूपण के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, इनमें से अधिकांश प्रणालियां एक्स-वाई विमान में तनाव क्षेत्र के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करती हैं, जिसमें जेड-दिशामें तनाव क्षेत्र पर सीमित जानकारी होती है। इसके अतिरिक्त, इन उपकरणों के केवल एक मुट्ठी भर सीटू इमेजिंग में सूक्ष्म करने में सक्षम हैं । सीटू उच्च आवर्धन इमेजिंग (जैसे, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप) में मुख्य चुनौती उद्देश्य लेंस से नमूने के लिए कुछ सौ माइक्रोन की सीमित कार्य दूरी है। जो उपकरण स्ट्रेच के दौरान लाइव इमेजिंग की अनुमति देते हैं , जेड– धुरी में तनाव की एकरूपता का त्याग करते हैं या अपेक्षाकृत जटिल होते हैं और अन्य प्रयोगशालाओं में प्रजनन करना मुश्किल होता है39,40.
3डी हाइड्रोगेल को फैलाने के लिए यह दृष्टिकोण लाइव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के दौरान स्थिर या चक्रीय एकक्षी तनाव के लिए अनुमति देता है। स्ट्रेचिंग डिवाइस (जिसे ‘स्मार्ट साइक्लिक यूनिएक्सियल स्ट्रेचर – स्कायस’ कहा जाता है) का निर्माण 3 डी मुद्रित भागों और कम लागत वाले हार्डवेयर का उपयोग करके किया जाता है, जिससे अन्य प्रयोगशालाओं में आसान प्रजनन की अनुमति होती है। डिवाइस से जुड़ा एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिकॉन रबर है जिसके केंद्र में ज्यामितीय कट-आउट है। कट-आउट को भरने के लिए हाइड्रोगेल घटकों को बहुलीकृत किया जाता है। बहुलीकरण के दौरान, बायोलॉजिकल हाइड्रोगेल, जैसे फिब्रिन या कोलेजन, स्वाभाविक रूप से कट-आउट की आंतरिक दीवारों का पालन करते हैं। SCyUS का उपयोग करना, सिलिकॉन पट्टी uniaxially फैला है, एम्बेडेड 3 डी हाइड्रोगेल41को नियंत्रित उपभेदों को स्थानांतरित करता है।
यह प्रणाली अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में सुविधाओं और फायदों के अद्वितीय संयोजन के लिए अनुमति देती है। सबसे पहले, सिस्टम अपनी परिधि से मोटी 3 डी सॉफ्ट हाइड्रोगेल (>100 माइक्रोन मोटी, <1 केपीए कठोरता) के एकेक्सियल स्ट्रेचिंग की अनुमति देता है, जिसमें पूरेहाइड्रोगेल में जेड-समरूप विकृति होती है। ये हाइड्रोगेल पारंपरिक तन्य तकनीकों द्वारा सोचने और फैलाए जाने के लिए बहुत नरम हैं। दूसरा, स्ट्रेचिंग डिवाइस को अन्य प्रयोगशालाओं में आसानी से दोहराया जा सकता है क्योंकि 3डी प्रिंटिंग शोधकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध है और डिजाइन में इस्तेमाल होने वाले इलेक्ट्रॉनिक्स कम लागत वाले हैं । तीसरा, और शायद सबसे आकर्षक विशेषता, ज्यामिति और सिलिकॉन पट्टी में कट-आउट के आकार को आसानी से हेरफेर किया जा सकता है, जिससे ट्यूनेबल स्ट्रेन ग्रेडिएंट और बाउंड्री कंडीशन के साथ-साथ विभिन्न प्रकार के नमूना वॉल्यूम का उपयोग, कुछ माइक्रोलीटर तक नीचे हो सकता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल में लाइव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत एकीय खिंचाव द्वारा आगे बढ़ते 0.5 मिमी मोटी सिलिकॉन रबर स्ट्रिप्स में ~ 2 मिमी व्यास डिस्क में फिब्रिन जेल मोल्डिंग होते हैं। निम्नलिखित ज्यामितीय कट-आउट पर कार्य करने वाले उपभेदों को मापने और विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं, हाइड्रोगेल में विकसित आंतरिक उपभेदों के साथ-साथ विभिन्न खिंचाव जोड़तोड़ के बाद फाइबर संरेखण के परिणामस्वरूप विस्तार से चर्चा करता है। अंत में, हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को एम्बेड करने और उन्हें नियंत्रित बाहरी खिंचाव के लिए उजागर करने की संभावना पर चर्चा की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत विधि और प्रोटोकॉल काफी हद तक Roitblat Riba एट अल द्वारा हमारे पिछले अध्ययन पर आधारित हैं ।४१ हम यहां पूर्ण कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन (सीएडी), पायथन और SCyUS डिवाइस के माइक्रोकंट्रो?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहां शामिल कुछ आंकड़े कॉपीराइट क्लीयरेंस सेंटर से अनुमति द्वारा अनुकूलित किए गए हैं: स्प्रिंगर नेचर, बायोमेडिकल इंजीनियरिंग के इतिहास। लाइव माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, ए रोइब्लाट रिबा, एस नाटान, ए कोलेल, एच रुशकिन, ओ त्चिचेयान, ए लेसमैन, कॉपीराइट© (2019) को सक्षम करते हुए एक समान जेड-एक्सिस उपभेदों के साथ 3डी हाइड्रोगेल्स को तनाव देते हैं।
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Materials
| Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
| Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
| Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
| DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
| EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
| Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
| Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
| High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
| HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
| SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
| Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
| Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
| Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
| USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
| Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
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