JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Bio-ingénierie

Kontrollert stamme av 3D-hydrogeler under levende mikroskopiavbildning

Published: December 04, 2020
doi:
10.3791/61671
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering,Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems,Tel-Aviv University

Summary

Den presenterte metoden innebærer uniaxial strekking av 3D myke hydrogeler innebygd i silikongummi samtidig som levende konfokal mikroskopi tillates. Karakterisering av ytre og indre hydrogelstammer samt fiberjustering er demonstrert. Enheten og protokollen som er utviklet, kan vurdere cellenes respons på ulike strekkregimer.

Abstract

Eksterne krefter er en viktig faktor i vevsdannelse, utvikling og vedlikehold. Effektene av disse kreftene studeres ofte ved hjelp av spesialiserte in vitro stretching metoder. Ulike tilgjengelige systemer bruker 2D-substratbaserte bårer, mens tilgjengeligheten av 3D-teknikker for å spenne myke hydrogeler, er mer begrenset. Her beskriver vi en metode som tillater ekstern strekking av myke hydrogeler fra omkretsen, ved hjelp av en elastisk silikonstrimmel som prøvebærer. Strekksystemet som brukes i denne protokollen er konstruert av 3D-trykte deler og rimelig elektronikk, noe som gjør det enkelt og enkelt å replikere i andre laboratorier. Den eksperimentelle prosessen begynner med å polymerisere tykke (>100 μm) myke fibrinhydrgeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) i en utskjæring i midten av en silikonstrimmel. Silikon-gelkonstruksjoner festes deretter til den trykte strekkenheten og plasseres på det konfiske mikroskopstadiet. Under levende mikroskopi aktiveres strekkenheten, og gelene er avbildet i forskjellige strekkstørrelser. Bildebehandling brukes deretter til å kvantifisere de resulterende geldeformasjonene, som demonstrerer relativt homogene stammer og fiberjustering gjennom gelens 3D-tykkelse (Z-aksen). Fordelene ved denne metoden inkluderer evnen til å spenne ekstremt myke hydrogeler i 3D mens du utfører in situ-mikroskopi, og friheten til å manipulere geometrien og størrelsen på prøven i henhold til brukerens behov. I tillegg, med riktig tilpasning, kan denne metoden brukes til å strekke andre typer hydrogeler (f.eks. kollagen, polyakrylamid eller polyetylenglykol) og kan tillate analyse av celler og vevsrespons på eksterne krefter under mer biomimetiske 3D-forhold.

Introduction

Vevsrespons på mekaniske krefter er en integrert del av et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert genuttrykk1, celledifferensiering2og vevsoppussing3. Videre kan kraftinduserte endringer i den ekstracellulære matrisen (ECM) som fiberjustering og fortetting påvirke celleadferd og vevsdannelse4,5,6. ECM’s fibrøse maskestruktur har spennende mekaniske egenskaper, for eksempel ikke-lineær elastisitet, ikke-affindeformasjon og plastdeformasjoner7,8,9,10,11,12. Disse egenskapene påvirker hvordan celler og deres omkringliggende mikromiljø reagerer på eksterne mekaniske krefter13,14. Å forstå hvordan ECM og vev reagerer på mekaniske krefter vil muliggjøre fremgang innen vevsteknikk og i utviklingen av mer nøyaktige beregnings- og teoretiske modeller.

De vanligste metodene for mekanisk strekkprøver har fokusert på cellebelastede 2D-substrater for å utforske effektene på celleadferd. Disse inkluderer for eksempel å påføre belastning på PDMS-substrater (polydimetylsiloksan) og analysere cellereorienteringsvinkler i forhold til strekkretningen15,16,17,18,19. Likevel er metoder som undersøker responsen til 3D-celleinbygde hydrogeler til ekstern strekk, en situasjon som nærmere etterligner vevsmikromiljø, mer begrenset. Fremskritt mot 3D-strekkmetoder er spesielt viktig fordi celler oppfører seg annerledes på 2D-substrater sammenlignet med 3D-matriser20. Disse virkemåtene omfatter cellulær omjustering, proteinuttrykksnivåer og overføringsmønstre21,22,23.

Metoder og enheter som tillater 3D-prøvestrekking inkluderer både kommersielt tilgjengelig24,25,26,27,28 og de som er utviklet for laboratorieforskning29. Disse metodene bruker distensible silikonrør30, multibrønnkamre31, klemmer26,32, bioreaktorer11,33, cantilevers34,35,36og magneter37,38. Noen teknikker genererer strekk som lokalt deformerer 3D-hydrogeler, for eksempel ved å trekke nåler fra to enkeltpunkter igelen 5, mens andre tillater deformasjon av hele hoveddelen av gelen16. Videre fokuserer de fleste av disse systemene på analyse av strekkfeltet i X-Y-planet, med begrenset informasjon om strekkfeltet i Z-retningen. I tillegg er bare en håndfull av disse enhetene i stand til mikroskopisk in situ-avbildning. Hovedutfordringen med in situ høyforstørrelsesavbildning (f.eks. konfokalt mikroskop) er den begrensede arbeidsavstanden til noen få hundre mikron fra objektivet til prøven. Enheter som tillater levende bildebehandling under strekkoffer ensartethet av belastning i Z-akseneller er relativt komplekse og vanskelige å reprodusere i andre laboratorier39,40.

Denne tilnærmingen til å strekke 3D-hydrogeler gir statisk eller syklisk uniaxial belastning under levende konfokal mikroskopi. Strekkenheten (referert til som ‘Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS’) er konstruert ved hjelp av 3D-trykte deler og rimelig maskinvare, noe som gir enkel reproduksjon i andre laboratorier. Festet til enheten er en kommersielt tilgjengelig silikongummi med en geometrisk utskjæring i midten. Hydrogelkomponenter polymeriseres for å fylle utskjæringen. Under polymerisasjon holder biologiske hydrogeler, som fibrin eller kollagen, naturlig til de indre veggene i utskjæringen. Ved hjelp av SCyUS er silikonstripen uniaxially strukket, og overfører kontrollerte stammer til den innebygde 3D-hydrogelen41.

Dette systemet gir en unik kombinasjon av funksjoner og fordeler sammenlignet med andre eksisterende metoder. For det første tillater systemet uniaxial strekking av tykke 3D myke hydrogeler (>100 μm tykk, <1 kPa stivhet) fra periferien, med Z-homogendeformasjon gjennom hele hydrogelen. Disse hydrogelene er for myke til å gripes og strekkes av konvensjonelle strekkteknikker. For det andre kan strekkenheten enkelt replikeres i andre laboratorier siden 3D-utskrift er lett tilgjengelig for forskere, og elektronikken som brukes i designet er rimelig. For det tredje, og kanskje den mest attraktive funksjonen, kan geometrien og størrelsen på utskjæringen i silikonstripen enkelt manipuleres, noe som gir justerbare belastningsgradienter og grenseforhold samt bruk av en rekke prøvevolumer, ned til noen få mikroliter.

Den presenterte protokollen består av støping fibrin gel i ~ 2 mm diameter disker i 0,5 mm tykke silikon gummi strimler som drives av uniaxial strekk under levende konfokal mikroskopi. Følgende diskuterer i detalj de eksperimentelle prosedyrene for måling og analyse av stammene som virker på den geometriske utskjæringen, de indre stammene utviklet i hydrogelen, samt resulterende fiberjustering etter ulike strekkmanipulasjoner. Til slutt diskuteres muligheten for å legge inn celler i hydrogelen og utsette dem for kontrollert ekstern strekk.

Protocol

1. Løsningsforberedelse (skal utføres på forhånd) Fibrinogen merkingMERK: Merketrinnet er bare nødvendig hvis det er ønskelig å analysere deformasjonen av fibringelen. For cellulære eksperimenter er det mulig å bruke en umerket gel. Tilsett 38 μL 10 mg/ml succinimidylstereorescerende fargestoff (oppløst i DMSO) til 1,5 ml 15 mg/ml fibrinogenoppløsning (molarforhold på 5:1) i et 50 ml sentrifugerør og legg på en shaker i 1 time ved romtemperatur. Deretter plasserer du røret i sentrifu…

Representative Results

Representative data fra statisk strekning av økende størrelser påført silikonstripen som bærer en 3D fibrin hydrogel, innebygd med 1 μm fluorescerende perler, er vist i figur 9. Analysen viser effekten av silikonstrekk på geometriske endringer i utskjæringen samt de utviklede stammene i gelen. Z-stakkbilderav hele gelen brukes til å evaluere deformasjonen av den opprinnelige sirkelformede utskjæringen til elliptisk geometri (figur 9A)…

Discussion

Metoden og protokollen som presenteres her er i stor grad basert på vår tidligere studie av Roitblat Riba et al.41 Vi inkluderer her hele dataassistert design (CAD), Python og mikrokontrollerkoder for SCyUS-enheten.

De viktigste fordelene ved den presenterte metoden over eksisterende tilnærminger inkluderer muligheten til å spenne svært myke 3D-hydrogeler (Elastic Modulus på ~ 100 Pa) fra omkretsen, og under levende konfokal avbildning. Andre met…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Noen figurer som er inkludert her har blitt tilpasset ved tillatelse fra Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Anstrengende 3D-hydrogeler med ensartede z-aksestammer samtidig som levende mikroskopiavbildning, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor – TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. . Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

Tags

3D HydrogelsLive Microscopy ImagingMechanical CuesBiomechanical ResponsesHydrogel GeometryCell ResponseExtracellular MatrixDisease ProgressionCancer TherapiesFibrin GelFibrinogenThrombinPBSStretching DeviceSilicone Strip

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image