Контролируемое напряжение 3D-гидрогелей при визуализации живой микроскопии
Summary
Представленный способ включает одноосное растяжение 3D мягких гидрогелей, встроенных в силиконовую резину, при этом позволяя проводить живую конфокальную микроскопию. Показано определение характеристик внешних и внутренних деформаций гидрогеля, а также выравнивание волокон. Разработанное устройство и протокол могут оценивать реакцию клеток на различные режимы деформации.
Abstract
Внешние силы являются важным фактором в формировании, развитии и поддержании тканей. Воздействие этих сил часто изучается с использованием специализированных методов растяжения in vitro. Различные доступные системы используют носилки на основе 2D-подложки, в то время как доступность 3D-методов для деформации мягких гидрогелей более ограничена. Здесь мы описываем метод, который позволяет внешне растягивать мягкие гидрогели от их окружности, используя упругую силиконовую полосу в качестве носителя образца. Система растяжения, используемая в этом протоколе, построена из 3D-печатных деталей и недорогой электроники, что делает ее простой и легкой для воспроизведения в других лабораториях. Экспериментальный процесс начинается с полимеризации толстых (>100 мкм) мягких гидрогелей фибрина (модуль упругости ~100 Па) в вырезе в центре силиконовой полосы. Силикон-гелевые конструкции затем прикрепляются к печатно-растягивающей устройству и помещаются на ступень конфокального микроскопа. При живой микроскопии активируется растягивающее устройство, и гели визуаизируются с различной величиной растяжения. Затем обработка изображений используется для количественной оценки результирующих деформаций геля, демонстрируя относительно однородные деформации и выравнивание волокон по всей толщине геля 3D (осьZ). Преимущества этого метода включают в себя возможность деформации чрезвычайно мягких гидрогелей в 3D при выполнении микроскопии in situ и свободу манипулировать геометрией и размером образца в соответствии с потребностями пользователя. Кроме того, при правильной адаптации этот метод может быть использован для растяжения других типов гидрогелей (например, коллагена, полиакриламида или полиэтиленгликоля) и может позволить анализировать реакцию клеток и тканей на внешние силы в более биомиметических 3D-условиях.
Introduction
Реакция тканей на механические силы является неотъемлемой частью широкого спектра биологических функций, включая экспрессию генов1,дифференцировку клеток2и ремоделированиетканей 3. Кроме того, вызванные силой изменения во внеклеточном матриксе (ECM), такие как выравнивание и уплотнение волокон, могут влиять на поведение клеток и формирование тканей4,5,6. Структура волокнистой сетки ECM обладает интригующими механическими свойствами, такими как нелинейная упругость, неаффинная деформация и пластические деформации7,8,9,10,11,12. Эти свойства влияют на то, как клетки и окружающая их микросреда реагируют на внешние механические силы13,14. Понимание того, как ECM и ткани реагируют на механические силы, позволит прогрессировать в области тканевой инженерии и в разработке более точных вычислительных и теоретических моделей.
Наиболее распространенные методы механического растяжения образцов были сосредоточены на 2D-субстратах, нагруженных клетками, чтобы изучить влияние на поведение клеток. К ним относятся, например, нанесение деформации на подложки из полидиметилсилоксана (PDMS) и анализ углов переориентации клеток по отношению к направлению растяжения15,16,17,18,19. Тем не менее, методы, исследующие реакцию 3D-гидрогелей, встроенных в клетки, на внешнее растяжение, ситуацию, которая более точно имитирует микроокружение тканей, более ограничены. Достижения в области методов 3D-растяжения имеют особое значение, потому что клетки ведут себя по-разному на 2D-подложках по сравнению с 3D-матрицами20. Это поведение включает клеточную перестройку, уровни экспрессии белка и модели миграции21,22,23.
Методы и устройства, позволяющие растягивать 3D-образец, включают как коммерчески доступные24,25,26,27,28, так и разработанные для лабораторных исследований29. В этих методах используются рассываемые силиконовые трубки30,многозаборные камеры31,зажимы26,32,биореакторы11,33,консольныекамеры 34,35,36и магниты37,38. Некоторые методы генерируют растяжение, которое локально деформирует 3D-гидрогели, например, путем вытягивания игл из двух отдельных точек вгеле 5,в то время как другие допускают деформацию всей массы геля16. Более того, большинство из этих систем сосредоточены на анализе поля деформации в плоскости X-Y, с ограниченной информацией о поле деформации в Z-направлении. Кроме того, только несколько из этих устройств способны к микроскопической визуализации in situ. Основной проблемой визуализации in situ с высоким увеличением (например, конфокального микроскопа) является ограниченное рабочее расстояние в несколько сотен микрон от объектива до образца. Устройства, которые действительно позволяют визуализировать в реальном времени во время растяжения, жертвуют однородностью деформации в оси Zили относительно сложны и трудно воспроизводятся в других лабораториях39,40.
Такой подход к растяжению 3D-гидрогелей позволяет проводить статическую или циклическую одноосную деформацию во время живой конфокальной микроскопии. Растягивающее устройство (называемое «Smart Cyclic Uniaxial Stretcher — SCyUS») построено с использованием 3D-печатных деталей и недорогого оборудования, что позволяет легко воспроизводить в других лабораториях. К устройству прилагается коммерчески доступная силиконовая резина с геометрическим вырезом в центре. Компоненты гидрогеля полимеризуются для заполнения выреза. Во время полимеризации биологические гидрогели, такие как фибрин или коллаген, естественным образом прилипают к внутренним стенкам выреза. Используя SCyUS, силиконовая полоса ненатягивается, передавая контролируемые деформации во встроенный 3D-гидрогель41.
Эта система позволяет обеспечить уникальное сочетание функций и преимуществ по сравнению с другими существующими методами. Во-первых, система позволяет одноосное растяжение толстых 3D-мягких гидрогелей (толщиной >100 мкм, жесткость <1 кПа) с их периферии с Z-однороднойдеформацией по всему гидрогелю. Эти гидрогели слишком мягкие, чтобы их можно было сжимать и растягивать обычными методами растяжения. Во-вторых, растягивающее устройство может быть легко воспроизведено в других лабораториях, поскольку 3D-печать легко доступна для исследователей, а электроника, используемая в дизайне, является недорогой. В-третьих, и, возможно, самая привлекательная особенность, геометрия и размер выреза в силиконовой полосе могут быть легко обработаны, что позволяет настраивать градиенты деформации и граничные условия, а также использовать различные объемы образцов, вплоть до нескольких микролитров.
Представленный протокол состоит из формования фибринового геля в диски диаметром ~2 мм в силиконовых резиновых полосах толщиной 0,5 мм, продолженных одноосным растяжением под живой конфокальной микроскопией. Далее подробно обсуждаются экспериментальные процедуры измерения и анализа деформаций, действующих на геометрический вырез, внутренние деформации, выработанные в гидрогеле, а также результирующее выравнивание волокон после различных манипуляций с растяжением. Наконец, обсуждается возможность встраивания клеток в гидрогель и воздействия на них контролируемого внешнего растяжения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способ и протокол, представленные здесь, в значительной степени основаны на нашем предыдущем исследовании Roitblat Riba et al.41 Мы включаем здесь полное автоматизированное проектирование (CAD), Python и коды микроконтроллеров устройства SCyUS.
К основным преимущества…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Некоторые фигуры, включенные здесь, были адаптированы с разрешения Центра проверки авторских прав: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Процеживание 3D-гидрогелей с однородными деформациями оси Z при одновременном создании изображений в живой микроскопии, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Materials
| Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
| Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
| Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
| DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
| EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
| Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
| Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
| High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
| HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
| SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
| Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
| Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
| Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
| USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
| Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
References
- Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
- Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
- Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
- Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
- Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. . Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
- Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
- Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
- Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
- Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
- Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
- Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
- Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
- Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
- Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
- Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
- Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
- Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
- Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
- Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
- Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
- CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
- STREX. STB-150. STREX. , (2019).
- STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
- Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
- Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
- Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
- Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
- Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
- Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
- Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
- Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
- Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
- Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
- Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
- Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
- Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
- Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
- Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
- Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
- Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
- Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
- Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
- Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
- Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).
