Cepa controlada de hidrogeles 3D bajo imágenes de microscopía en vivo

Summary

El método presentado implica el estiramiento uniaxial de hidrogeles blandos 3D incrustados en caucho de silicona mientras permite la microscopía confocal viva. Se demuestra la caracterización de las cepas de hidrogel externas e internas, así como la alineación de la fibra. El dispositivo y el protocolo desarrollados pueden evaluar la respuesta de las células a diversos regímenes de deformación.

Abstract

Las fuerzas externas son un factor importante en la formación, el desarrollo y el mantenimiento de los tejidos. Los efectos de estas fuerzas se estudian a menudo utilizando métodos de estiramiento in vitro especializados. Varios sistemas disponibles utilizan camillas basadas en sustrato 2D, mientras que la accesibilidad de las técnicas 3D para tensar hidrogeles blandos, es más restringida. Aquí, describimos un método que permite el estiramiento externo de hidrogeles blandos de su circunferencia, utilizando una tira de silicona elástica como el portador de la muestra. El sistema de estiramiento utilizado en este protocolo está construido a partir de piezas impresas en 3D y electrónica de bajo costo, por lo que es simple y fácil de replicar en otros laboratorios. El proceso experimental comienza con hidrogeles de fibrina blanda polimerización (>100 μm) (módulo elástico de ~ 100 Pa) en un recorte en el centro de una tira de silicona. Las construcciones de gel de silicona se unen al dispositivo de estiramiento impreso y se colocan en la etapa de microscopio confocal. Bajo microscopía en vivo, se activa el dispositivo de estiramiento, y los geles se muestran en varias magnitudes de estiramiento. El procesamiento de imágenes se utiliza para cuantificar las deformaciones de gel resultantes, demostrando cepas relativamente homogéneas y alineación de fibras a lo largo del espesor 3D del gel (ejeZ). Las ventajas de este método incluyen la capacidad de colar hidrogeles extremadamente blandos en 3D mientras se ejecuta microscopía in situ, y la libertad de manipular la geometría y el tamaño de la muestra de acuerdo con las necesidades del usuario. Además, con la adaptación adecuada, este método se puede utilizar para estirar otros tipos de hidrogeles (por ejemplo, colágeno, poliacrilamida o polietilenglicol) y puede permitir el análisis de las células y la respuesta de los tejidos a las fuerzas externas en condiciones 3D más biomiméticas.

Introduction

La respuesta tisular a las fuerzas mecánicas es una parte integral de una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la expresión^{génica 1,}la diferenciación celular^2,y la remodelación tisular^3. Por otra parte, los cambios inducidos por la fuerza en la matriz extracelular (ECM) tales como alineación y densificación de la fibra pueden afectar comportamiento de la célula y la formación del tejido^4,5,6. La estructura de malla fibrosa del ECM tiene propiedades mecánicas intrigantes, como elasticidad no lineal, deformación no afín y deformaciones plásticas^{7,8,9,10,11,12.} Estas propiedades afectan la forma en que las células y su microambiente circundante responden a las fuerzas mecánicas externas^13,14. Comprender cómo responden el ECM y los tejidos a las fuerzas mecánicas permitirá avanzar en el campo de la ingeniería de tejidos y en el desarrollo de modelos computacionales y teóricos más precisos.

Los métodos más comunes para estirar mecánicamente las muestras se han centrado en sustratos 2D cargados de células para explorar los efectos sobre el comportamiento celular. Estos incluyen, por ejemplo, la aplicación de deformación a sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) y el análisis de los ángulos de reorientación celular en relación con la dirección de estiramiento^{15,16,17,18,19.} Sin embargo, los métodos que investigan la respuesta de los hidrogeles incrustados en células 3D al estiramiento externo, una situación que imita más de cerca el microambiente tisular, son más limitados. Los avances hacia los métodos de estiramiento 3D son de particular importancia porque las células se comportan de manera diferente en sustratos 2D en comparación con las matrices 3D²⁰. Estos comportamientos incluyen realineamiento celular, niveles de expresión de proteínas y patrones de migración^21,22,23.

Los métodos y dispositivos que permiten el estiramiento de muestras en 3D incluyen tanto los disponibles comercialmente^{24,25,26,27,28} como los desarrollados para la investigación de laboratorio^29. Estos métodos utilizan tubos de silicona distensibles^30,cámaras multi-pozo^31,abrazaderas^26,32,biorreactores^11,33,voladizos^34,35,36,e^{imanes 37,38.} Algunas técnicas generan estiramientos que localmente deforman hidrogeles 3D, por ejemplo tirando de agujas de dos puntos individuales en el gel^5,mientras que otras permiten la deformación de todo el bulto del gel^16. Además, la mayoría de estos sistemas se centran en el análisis del campo de deformación en el plano X-Y, con información limitada sobre el campo de deformación en la dirección Z. Además, sólo un puñado de estos dispositivos son capaces de imágenes microscópicas in situ. El principal desafío con las imágenes de gran aumento in situ (por ejemplo, microscopio confocal) es la distancia de trabajo limitada de unos pocos cientos de micras desde la lente objetivo hasta la muestra. Los dispositivos que permiten la obtención de imágenes en vivo durante el estiramiento sacrifican la uniformidad de la tensión en el eje Zo son relativamente complejos y difíciles de reproducir en otros laboratorios^39,40.

Este enfoque para estirar hidrogeles 3D permite la deformación uniaxial estática o cíclica durante la microscopía confocal viva. El dispositivo de estiramiento (conocido como ‘Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS’) está construido utilizando piezas impresas en 3D y hardware de bajo costo, lo que permite una fácil reproducción en otros laboratorios. Unido al dispositivo hay un caucho de silicona disponible comercialmente con un recorte geométrico en su centro. Los componentes de hidrogel se polimerizan para rellenar el recorte. Durante la polimerización, los hidrogeles biológicos, como la fibrina o el colágeno, se adhieren naturalmente a las paredes interiores del recorte. Usando el SCyUS, la tira de silicona se estira uniaxally, transfiriendo tensiones controladas al hidrogel 3D embebido^41.

Este sistema permite una combinación única de características y ventajas en comparación con otros métodos existentes. En primer lugar, el sistema permite el estiramiento uniaxial de hidrogeles blandos 3D gruesos (>100 μm de espesor, rigidez de <1 kPa) desde su periferia, con deformación homogénea en Zen todo el hidrogel. Estos hidrogeles son demasiado blandos para ser agarrados y estirados por técnicas de tracción convencionales. En segundo lugar, el dispositivo de estiramiento se puede replicar fácilmente en otros laboratorios, ya que la impresión 3D está disponible para los investigadores y la electrónica utilizada en el diseño es de bajo costo. En tercer lugar, y quizás la característica más atractiva, la geometría y el tamaño del recorte en la tira de silicona se pueden manipular fácilmente, lo que permite gradientes de deformación ajustables y condiciones de contorno, así como el uso de una variedad de volúmenes de muestra, hasta unos pocos microlitros.

El actual protocolo consiste en moldear el gel de la fibrina en discos del diámetro de ~2 milímetros en tiras de goma gruesas del silicón de 0.5 milímetros procedidas por el estiramiento uniaxial bajo microscopia confocal viva. A continuación se analizan en detalle los procedimientos experimentales para medir y analizar las cepas que actúan sobre el recorte geométrico, las cepas internas desarrolladas en el hidrogel, así como la alineación de fibras resultante después de varias manipulaciones de estiramiento. Finalmente, la posibilidad de incrustar las células en el hidrogel y de exponerlas al estiramiento externo controlado se discute.

Protocol

1. Preparación de la solución (que se realizará con antelación) Etiquetado de fibrinógenoNOTA: El paso de etiquetado es necesario sólo si se desea analizar la deformación del gel de fibrina. Para experimentos celulares, es posible usar un gel sin etiquetar. Añadir 38 μL de 10 mg/mL de colorante fluorescente de éster succinimidilo (disuelto en DMSO) a 1,5 mL de solución de fibrinógeno de 15 mg/mL (relación molar de 5:1) en un tubo de centrífuga de 50 mL y colocar en una coctelera durant…

Representative Results

Los datos representativos del estiramiento estático de magnitudes crecientes aplicado a la tira de silicona portadora de un hidrogel de fibrina 3D, embebido con perlas fluorescentes de 1 μm, se muestran en la Figura 9. El análisis demuestra el efecto del estiramiento de silicona en los cambios geométricos del recorte, así como las cepas desarrolladas dentro del gel. Lasimágenes de pila Z de todo el gel se utilizan para evaluar la deformación del recorte original en f…

Discussion

El método y el protocolo presentados aquí se basan en gran medida en nuestro estudio anterior de Roitblat Riba et al.⁴¹ Incluimos aquí el diseño completo asistido por computadora (CAD), Python y los códigos de microcontrolador del dispositivo SCyUS.

Las principales ventajas del método presentado sobre los enfoques existentes incluyen la posibilidad de colar hidrogeles 3D muy suaves (módulo elástico de ~ 100 Pa) desde su circunferencia, y bajo imágenes …

Materials

Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose)	Biological Industries	01-052-1A	Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5	Bar-Naor Ltd.	BN72204-30	22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO	Sigma-Aldrich Inc.	D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Biological Industries	02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human)	Omrix Biopharmaceuticals	3902	Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer	N/A		Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm)	Invitrogen	F8820	Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber	McMaster-Carr	3788T41	580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)	GE Healthcare	17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound	Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.	HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39	National Institute of Health, Bethesda, MD	Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)	Arduino/Adafruit	Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge	Thermo Scientific	75002470
Parafilm	Bemis	PM-996
Primovert Light Microscope	Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.	491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks)	Dassault Systèmes	N/A
SCyUS Code37	N/A	N/A
Servomotor – TowerPro SG-5010	Adafruit	155
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030	For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates	Corning	430167
Thrombin buffer	N/A		Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male)	N/A	N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope	Carl Zeiss AG	2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)	Carl Zeiss AG	Release Version 14.0.0.0