De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.
Externe krachten zijn een belangrijke factor bij weefselvorming, ontwikkeling en onderhoud. De effecten van deze krachten worden vaak bestudeerd met behulp van gespecialiseerde in vitro rekmethoden. Verschillende beschikbare systemen maken gebruik van 2D substraat-gebaseerde brancards, terwijl de toegankelijkheid van 3D-technieken om zachte hydrogels te belasten, beperkter is. Hier beschrijven we een methode die het mogelijk maakt om zachte hydrogels van hun omtrek extern uit te rekken, met behulp van een elastische siliconenstrip als monsterdrager. Het stretching-systeem dat in dit protocol wordt gebruikt, is opgebouwd uit 3D-geprinte onderdelen en goedkope elektronica, waardoor het eenvoudig en gemakkelijk te repliceren is in andere laboratoria. Het experimentele proces begint met het polymeriseren van dikke (>100 μm) zachte fibrine hydrogels (Elastische Modulus van ~100 Pa) in een uitsparing in het midden van een siliconenstrip. Siliconengelconstructies worden vervolgens aan het bedrukte rekapparaat bevestigd en op het confocale microscoopstadium geplaatst. Onder live microscopie wordt het rekapparaat geactiveerd en worden de gels op verschillende rekgroottes afgebeeld. Beeldverwerking wordt vervolgens gebruikt om de resulterende gelvervormingen te kwantificeren, waarbij relatief homogene stammen en vezeluitlijning worden aangetoond over de 3D-dikte van de gel(Z-as). Voordelen van deze methode zijn onder meer de mogelijkheid om extreem zachte hydrogels in 3D te belasten tijdens het uitvoeren van in situ microscopie, en de vrijheid om de geometrie en grootte van het monster te manipuleren volgens de behoeften van de gebruiker. Bovendien kan deze methode met de juiste aanpassing worden gebruikt om andere soorten hydrogels (bijv. collageen, polyacrylamide of polyethyleenglycol) uit te rekken en kan het mogelijk zijn om cellen en weefselrespons op externe krachten te analyseren onder meer biomimetische 3D-omstandigheden.
Weefselrespons op mechanische krachten is een integraal onderdeel van een breed scala aan biologische functies, waaronder genexpressie1, celdifferentiatie2en weefselremodellering3. Bovendien kunnen door kracht geïnduceerde veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) zoals vezeluitlijning en verdichting het celgedrag en weefselvormingbeïnvloeden 4,5,6. De vezelige meshstructuur van het ECM heeft intrigerende mechanische eigenschappen, zoals niet-lineaire elasticiteit, niet-affine vervorming en plastische vervormingen7,8,9,10,11,12. Deze eigenschappen beïnvloeden hoe cellen en hun omringende micromilieu reageren op externe mechanische krachten13,14. Inzicht in hoe het ECM en weefsels reageren op mechanische krachten zal vooruitgang mogelijk maken op het gebied van weefseltechnologie en in de ontwikkeling van nauwkeurigere computationele en theoretische modellen.
De meest voorkomende methoden om monsters mechanisch uit te rekken, hebben zich gericht op met cellen beladen 2D-substraten om de effecten op celgedrag te onderzoeken. Deze omvatten bijvoorbeeld het toepassen van stam op polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten en het analyseren van celheroriëntatiehoeken ten opzichte van de rekrichting15,16,17,18,19. Toch zijn methoden die de reactie van 3D-celgeïnteceerde hydrogels op externe stretch onderzoeken, een situatie die weefselmicromilieu nauwer nabootst, beperkter. Vooruitgang in de richting van 3D-rekmethoden is van bijzonder belang omdat cellen zich anders gedragen op 2D-substraten in vergelijking met 3D-matrices20. Deze gedragingen omvatten cellulaire herschikking, eiwitexpressieniveaus en migratiepatronen21,22,23.
Methoden en apparaten die het uitrekken van 3D-monsters mogelijk maken , omvatten zowel in de handel verkrijgbare24,25,26,27,28 als die welke zijn ontwikkeld voor laboratoriumonderzoek29. Deze methoden gebruiken opgezette siliconen buizen30,multi-well kamers31,klemmen 26,32,bioreactoren11,33,cantilevers34,35,36,en magneten37,38. Sommige technieken genereren stretch die lokaal 3D-hydrogels vervormt, bijvoorbeeld door naalden van twee enkele punten in de gel te trekken5, terwijl andere vervorming van het hele grootste deel van de gel mogelijk maken16. Bovendien richten de meeste van deze systemen zich op de analyse van het spanningsveld in het X-Y-vlak, met beperkte informatie over het spanningsveld in de Z-richting. Bovendien zijn slechts een handvol van deze apparaten in staat tot microscopische beeldvorming in situ. De grootste uitdaging bij in situ high-magnification imaging (bijv. confocale microscoop) is de beperkte werkafstand van enkele honderden micron van de objectieve lens tot het monster. Apparaten die live beeldvorming tijdens stretch mogelijk maken, offeren de uniformiteit van de spanning in de Z-asop of zijn relatief complex en moeilijk te reproduceren in andere laboratoria39,40.
Deze benadering van stretch 3D hydrogels zorgt voor statische of cyclische uniaxiale belasting tijdens live confocale microscopie. Het rekapparaat (aangeduid als ‘Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS’) is gemaakt van 3D-geprinte onderdelen en goedkope hardware, waardoor eenvoudige reproductie in andere laboratoria mogelijk is. Aan het apparaat is een in de handel verkrijgbaar siliconenrubber bevestigd met een geometrische uitsparing in het midden. Hydrogelcomponenten worden gepolymeriseerd om de uitsparing te vullen. Tijdens polymerisatie hechten biologische hydrogels, zoals fibrine of collageen, zich van nature aan de binnenwanden van de uitsparing. Met behulp van de SCyUS wordt de siliconenstrip uniaxiaal uitgerekt, waardoor gecontroleerde stammen worden overgebracht naar de ingebedde 3D-hydrogel41.
Dit systeem maakt een unieke combinatie van functies en voordelen mogelijk in vergelijking met andere bestaande methoden. Ten eerste maakt het systeem eenassige rek mogelijk van dikke 3D-zachte hydrogels (>100 μm dik, <1 kPa-stijfheid) uit hun periferie, met Z-homogenevervorming door de hydrogel. Deze hydrogels zijn te zacht om vast te pakken en uitgerekt te worden door conventionele trektechnieken. Ten tweede kan het rekapparaat gemakkelijk worden gerepliceerd in andere laboratoria, omdat 3D-printen direct beschikbaar is voor onderzoekers en de elektronica die in het ontwerp wordt gebruikt goedkoop is. Ten derde, en misschien wel het meest aantrekkelijke kenmerk, kunnen de geometrie en de grootte van de uitsparing in de siliconenstrip gemakkelijk worden gemanipuleerd, waardoor afstembare stamgradiënten en randvoorwaarden mogelijk zijn, evenals het gebruik van een verscheidenheid aan monstervolumes, tot een paar microliters.
Het gepresenteerde protocol bestaat uit het vormen van fibrinegel in schijven met een diameter van ~ 2 mm in 0,5 mm dikke siliconenrubberstrips die worden uitgevoerd door eenassige stretch onder levende confocale microscopie. Het volgende bespreekt in detail de experimentele procedures voor het meten en analyseren van de stammen die werken op de geometrische uitsparing, de interne stammen die in de hydrogel zijn ontwikkeld, evenals de resulterende vezeluitlijning na verschillende rekmanipulaties. Ten slotte wordt de mogelijkheid besproken om cellen in de hydrogel te verankeren en bloot te stellen aan gecontroleerde externe stretch.
De methode en het protocol die hierin worden gepresenteerd, zijn grotendeels gebaseerd op onze eerdere studie door Roitblat Riba et al.41 We nemen hier het volledige computerondersteunde ontwerp (CAD), Python en microcontrollercodes van het SCyUS-apparaat op.
De belangrijkste voordelen van de gepresenteerde methode ten opzichte van bestaande benaderingen zijn de mogelijkheid om zeer zachte 3D-hydrogels (Elastische Modulus van ~ 100 Pa) uit hun omtrek te belaste…
The authors have nothing to disclose.
Sommige figuren hier zijn aangepast met toestemming van het Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Spannen van 3D-hydrogels met uniforme z-asstammen terwijl live microscopiebeeldvorming mogelijk wordt, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |