Denne protokol har til formål at transplantere en 3D bioprinted patch på epicardium af infarkte mus modellering hjertesvigt. Det omfatter oplysninger om anæstesi, den kirurgiske bryst åbning, permanent ligation af venstre forreste faldende (LAD) koronararterie og anvendelse af en biotrykt patch på det infarkte område af hjertet.
Test regenerative egenskaber af 3D bioprintede hjerteplastre in vivo ved hjælp af murine modeller af hjertesvigt via permanent venstre forreste faldende (LAD) ligation er en udfordrende procedure og har en høj dødelighed på grund af sin art. Vi udviklede en metode til konsekvent at transplantere bioprintede pletter af celler og hydrogels på epicardium af en infarkted mus hjerte til at teste deres regenerative egenskaber på en robust og gennemførlig måde. For det første er en dybt bedøvet mus omhyggeligt intuberet og ventileret. Efter venstre lateral thoracotomy (kirurgisk åbning af brystet), den eksponerede LAD er permanent ligated og bioprintede patch transplanteret på epiardium. Musen hurtigt genopretter fra proceduren efter brystet lukning. Fordelene ved denne robuste og hurtige tilgang omfatter en forventet 28-dages dødelighed på op til 30% (lavere end de 44% rapporteret af andre undersøgelser ved hjælp af en lignende model af permanent LAD ligation hos mus). Desuden er den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne protokol, alsidig og kan tilpasses til test af biotrykte plastre ved hjælp af forskellige celletyper eller hydrogels, hvor der er behov for et stort antal dyr for at udføre effektundersøgelser optimalt. Samlet set præsenterer vi dette som en fordelagtig tilgang, som kan ændre prækliniske test i fremtidige undersøgelser for området for hjerte-regenerering og vævsteknik.
En hjertetransplantation er guld standard behandling for patienter med end-stage hjertesvigt, men der er mangel på donororganer. Det kræver immunsystemet undertrykkelse for at forhindre graft afvisning og den etårige dødelighed er 15% på verdensplan1. Derfor er der et mangeårigt incitament til at regenerere myokardiet i prækliniske dyremodeller med henblik på at oversætte til forsøg medmennesker 2,3,44,5,6,7,8,9. De seneste fremskridt inden for 3D-biotryk af stamceller eller stamceller afledte hjerteceller har fået opmærksomhed som en lovende tilgang til regenerering af myokardiet2,3,9,10,11,12.9
De første humane sikkerhedsforsøg anvender patches til at regenerere hjertet er blevet rapporteret, med autolog knoglemarv mononukleare celler suspenderet i kollagen eller embryonale stamceller-afledte hjertefogenitor celler i fibrin, transplanteret til epicardium7,8,13. Men for en mere præcis, skalerbar, automatable og reproducerbare metode, 3D bioprint af optimerede hydrogelpatches,der skal anvendes på den episardiale overflade af hjertet er en lovende tilgang til at regenerere myokardiet for patienter, der ellers ville have brug for en hjertetransplantation2,10,11,12.
Før oversættelse til forsøg på mennesker kan forekomme, prækliniske dyreforsøg er nødvendige. Prækliniske in vivo-modeller, der forfølger regenerering af myokardiet , er blevet rapporteret hos svin5,får 14,rotter 6 og mus4. En almindelig model af myokardie infarkt (MI) i mus bruger permanent ligation af venstre forreste faldende (LAD) koronararterie15,16. Blandt de forskellige stammer af mus, der anvendes, permanent LAD ligation i C57BL6 mus har en acceptabel overlevelsesrate og typisk præsenterer konsekvent remodeling og hjerteændringer efter MI16. I gnavere modeller, flere tilgange er blevet beskrevet, hvor hjertevæv er blevet anvendt til hjertet i forfølgelsen af effektiv regenerering af beskadiget myokardiet4,6,17. Mens store dyr stadig udgør en mere klinisk relevant model for at teste hjertegenerative egenskaber5,14, alsidigheden og gennemførligheden af musemodellen egner sig til denne hurtige bevægelse område af undersøgelsen. Dette kan undgå nogle af de faldgruber, der er typiske for store dyreforsøg, herunder (men ikke begrænset til): 1) høj dyredødelighed (medmindre diagonale kranspulsårer er ligeret, hvilket fører til uforudsigelige segmentale infarkter14, eller den distale ende af LAD’en er tilstoppet efterfulgt af reperfusion i stedet for permanent ligation5); 2) etiske problemer med den relativt øgede skade forårsaget af store dyreprotokoller sammenlignet med mus18; 3) øgede omkostninger og / eller gennemførlighed spørgsmål, for eksempel den relative mangel på store animalske udstyr såsom MR-scannere14. Det er også vigtigt at overveje, at de i betragtning af den omfattende varighed og engagement, der er typisk for store dyreforsøg, har potentiale til at blive forældede, før de er færdige, især med den hurtige udvikling, der er typisk på dette område. For eksempel er det først for nylig, at den kritiske rolle, som inflammatoriske celler og mæglere spiller i reguleringen af hjerteregenerering eropstået 19,20. Desuden er den kritiske rolle, som prækliniske undersøgelser, såsom små dyremodeller, har fremhævet af en Lancet-kommission som et vigtigt skridt til at opnå solid viden, før de går over til forsøg medmennesker 21.
For at lette fremskridt i forståelsesmekanismer og optimere betingelserne for patch-baserede hjerte regenerering tilgange in vivo, præsenterer vi en ny tilgang, der beskriver en ‘scoop og drapere’ metode til at anvende en 3D bioprintet alginat / gelatine hydrogel patch til overfladen af infarkte hjerter i C57BL6 mus. Formålet med denne tilgang er at tilvejebringe en alsidig in vivo-model til test af 3D-biotrykte plastre, som sandsynligvis vil være mulige i brede forskningssammenhænge for det hastigt udviklende område for hjerteregenerering2. Denne metode kan tilpasses til testplastre, der genereres ved hjælp af ikke-bioprintmetoder, forskellige hydrogeler og autologe eller allogene stamcellerinterede celler i plastre in vivo. Men, detaljerede overvejelser om bioprint, hydrogels eller celletyper er uden for rammerne af denne undersøgelse, som fokuserer på den kirurgiske transplantation metode.
Fordelene ved protokollen omfatter, at den myokardiemæssige infarkt og anvendelse af en biotrykt patch udføres i en kirurgisk procedure, der kan udføres hurtigt, med let tilgængelige, omkostningseffektive laboratorieredskaber og med en relativt lav dødelighed. Det giver også typisk mulighed for et større antal dyr end store dyremodeller i et mindre rum, hvilket muliggør en robust sammenligning af flere forsøgsgrupper, især nyttige til sammenligning af flere grupper in vivo. På den anden side har denne protokol ulemperne, at: 1) musemodellen er mere fjernt fra menneskets hjertestørrelse, anatomi og fysiologi end i store dyremodeller, og den udmønter sig ikke direkte til mennesker; 2) murine LAD grene proksimalt, med betydelig variation mellem de enkelte mus, hvilket fører til infarkt størrelse variation (et problem deles med store dyremodeller); 3) plasteret skal påføres over hele den forreste hjerteoverflade, som er mindre præcis end at påføre over et bestemt infarkt område; og 4) plasteret påføres straks på tidspunktet for MI (til human brug er det sandsynligt, at være mere klinisk nyttigt at udvikle et plaster til påføring på kronisk infarkted svigtende hjerte måneder efter den oprindelige MI14).
Ikke desto mindre kan denne protokol, hvis den vælges hensigtsmæssigt i henhold til den hypotese, der testes, hurtigt levere kritiske in vivo-data med høje antal på en måde, der er i overensstemmelse med de materialer, budget og ekspertise, der er til rådighed i de fleste laboratorier. Sammenlignet med store dyremodeller er det en in vivo-model, der er alsidig nok til at tilpasse sig nye 3D-bioprintteknologier (f.eks. ved den relative lethed at udføre pilotundersøgelser for at teste gennemførlighed og sikkerhed, før den går over til større dyremodeller). Det ville være velegnet til forskere, der ønsker at generere in vivo data effektivt og billigt, måske kører flere sammenligninger af 3D bioprintede patches med forskellige bioprint parametre, celler eller hydrogels i patches. Det ville især være nyttigt til at teste samspillet mellem forskellige blandinger af stamceller og stamceller afledte celler med hydrogels in vivo uden overskydende spild af dyre cellesting eller andre materialer, der kan opstå, hvis der anvendes store plastre. Anvendelse af en musemodel vil også gøre det lettere at teste plastre, der indeholder artskompatible celle- og stamcelleopdragninger eller humant afledte celler, hvor ensartede mus med en specifik immundefekt er ønskelig. Derudover kan testning i genetisk modificerede musestammer gøre det muligt for forskere at isolere virkningerne af specifikke gener på signalveje og i specifikke celletyper, der er relevante for hjerte-kar-sygdomme, hvilket ikke ville være muligt i en stor dyremodel.
Metoden letter operatøren til effektivt at transplantere en bioprintet patch ved at anvende det til den episardiale overflade af en infarkted mus hjerte efter permanent LAD ligation. I denne gennemførlighedsfokuserede metode er vi i stand til at udføre denne procedure på otte mus pr. arbejdsdag (herunder forberedelse af rummet før og efter). En bioprintkørsel, der producerer otte 1 cm2 plastre i brønde med seks brøndplader, tager 2-3 timer (inklusive forberedelsestiden før og efter). Vi brugte den sterile indersiden af en kirurgisk skalpel pakke som scoop for vores patch, som er let tilgængelig og generelt tilføjer minimale omkostninger, udnytte de naturlige klæbende egenskaber alginat / gelatine hydrogel patch til drapere plasteret på tværs af forreste infarkted overflade af hjertet. Det er vores erfaring, at protokollen for LAD ligation hos mus er operatørafhængig, og en lavere dødelighed på 28 dage kan opnås med erfarne operatører, der er specialiseret i én model. Van den Borne et al.16 rapporterede, at C57BL6 mus udgør en 44% dødelighed efter permanent LAD ligation på 28 dage uden anvendelse af et plaster, hvilket er højere end den øvre grænse på 30%, som vi observerede med metoden.
Intuberingstrinnet er kritisk, og in-and-of-itself kan være en kilde til dødelighed for mus, medmindre det udføres af en dygtig operatør. Det er gjort vanskeligt på grund af den lille størrelse af luftrøret, hvilket er grunden til forstørrelsesglas bæres af operatøren for dette trin. Vi bruger injiceret ketamin/xylazin samt inhaleret isofluorane til induktion af bedøvelsesmiddel, så musen er dybt bedøvet ved relativt lave doser af hvert lægemiddel. Derfor er der ingen risiko for musen til at vågne op i løbet af denne intubation trin, men den høje dødelighed forbundet med høje enkelt-drug doser undgås. Atropin blev også givet for at modvirke bivirkninger såsom bradykardi og hypersalivation. Brugen af et spotlight anvendes på halsen eksternt lyser luftrøret internt, så det er mere synligt, og stemmebåndene skal visualiseres åbning og lukning med musens respirationsfrekvens (normalt ~ 120 vejrtrækninger i minuttet). Det er afgørende at placere musen perfekt (hvilket er grunden til en hård overflade foretrækkes i stedet for en opvarmning måtten under musen for dette trin) med de to fortænder holdt af en loopet tråd og tungen trukket ekstremt forsigtigt med stumpe kraftbecer / par spatler til at åbne munden og visualisere luftrøret. Når intubationen er afsluttet, skal operatøren passe på ikke at løsne røret i overførslen fra intubationsområdet til operationssengen (som har en varmemåtte under den for at forhindre hypotermi). Ved tilslutning af åndedrætsrøret til ventilatorapparatet er det afgørende at stabilisere røret med den ene hånd og forbinde ventilatorkredsløbet med den anden, så åndedrætsrøret er minimalt, således at det skubbes dybere ind i luftrøret, når ventilatorsegmentet i slangen forbindes.
I denne undersøgelse brugte vi alginat 4% (w / v) / gelatine 8% (w / v) i Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Alginat/gelatinehydrgel er kendt for deres biokompatibilitet, lave omkostninger og biomekaniske egenskaber, hvilket gør dem nyttige for 3D-vævsudviklingsstrategier23. Disse hydrogels kan krydses af mild gelering ved at tilføje calciumioner, som giver mulighed for viskositet, der skal ændres. Efter bioprint anvendte vi calciumchlorid (CaCl2) 2% (w/v) i fosfat-bufferet saltvand (PBS) på plastre og dyrkede dem derefter i DMEM i seks brøndplader i 7-14 dage, før de transplanteres. Dette var det optimale vindue efter pletter indeholdende hjerteceller begyndte at slå i kultur, men før patches begyndte at smuldre. Mens CaCl2 kunne tilføjes regelmæssigt i hele post-bioprint fase for at reducere patch opløsning, fandt vi, at den iboende viskositet af hydrogel var tilstrækkelig til patches til at opretholde deres struktur op til transplantation med kun én indledende dosis af CaCl2.
Metoden tilladt for vellykket transplantation uden suturer (som kan beskadige hjertet) eller lim (som kan blokere grænsefladen mellem plasteret og hjertet). Fremtidige undersøgelser kan bekræfte hypotesen om, at suturløs og limfri transplantation ikke har en negativ indvirkning på engraftment hos mus, da det er afgørende, at plasteret ikke glider af hjertet eller forstyrrer lungerne. Andre undersøgelser, der vurderer engraftment af plastre i permanente LAD-ligationsmodeller med patchbaseret reparation3, har målt et bestemt område (mm2) tilbage medtiden 24, den podede patchtykkelse (μm) reminering med tid25, kvantificering af transplanterede celler ved polymerasekædereaktion (PCR)26 eller bioluminescensfotonmissionsfleksering af mærkede levende donorceller (et mål for fotoner, der udsendes pr. sekund, og som kan kvantificere mærkede podede celler, der overlever i levende dyr over tid)27. Fremtidige undersøgelser kan bruge disse metoder til yderligere at vurdere, om suturløs og limfri transplantation påvirker patch engraftment (samt strukturelle og funktionelle virkninger på værten myokardiet). Ikke desto mindre, makroskopisk efter 28 dage in vivo i vores immunkompetente mus, den forreste mediastinum præsenteret variabel fibrinous materiale og sammenvoksninger. Mekanismen for patch-baseret hjerteregenerering kan være fra stimulering af vært makrofaginflammatoriske reaktioner 19 eller udskilles immunologiskefaktorer 20 snarere end numerisk celle genopfyldning. Hvis inflammation spiller en positiv rolle, tilstedeværelsen af fremmed hydrogel materiale kan være gavnligt. Alternativt kan det være gavnligt at reducere tilstedeværelsen af fremmed materiale, hvis hydrogelkomponenten opløses over tid. Faktisk bruger nogle tilgange biomaterialer, som understøtter celler i første omgang og derefter opløses, så kun væv28,29. Fremtidige undersøgelser til fuldt ud at analysere patch engraftment og bedre forstå mekanismerne bag patch-baseret hjerteregenerering kan føre til optimeret eksperimentelle design før oversættelse til menneskelige forsøg2.
Samlet set er denne protokol sandsynligvis meget mulig og også velegnet til at teste flere grupper af 3D-bioprintede plastre, for eksempel med forskellige cellulære indhold. Fremtidige anvisninger for denne metode omfatter biotrykning af plastre, der indeholder avancerede hydrogeler, der ikke tidligere er testet in vivo, eller testning af virkningerne af forskellige autologe eller allogene stamcelleafledte celler til optimering, før de går videre til store dyremodeller.
The authors have nothing to disclose.
Med tak til Natalie Johnston for optagelsen af de ikke-kirurgiske optagelser og alle videoredigering.
3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
Atropine suplhate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals – 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |