ネコ大型動物モデルにおけるヒト胚性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植
Summary
ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜組織を大型動物モデルの網膜下腔に移植する手術手技について紹介する。
Abstract
加齢黄斑変性症(AMD)、網膜色素変性症(RP)、レーバー先天性アマウロシス(LCA)などの光受容体喪失に関連する網膜変性(RD)状態は、進行性および衰弱性の視力喪失を引き起こします。光受容体が失われた後に視力を回復させることができる治療法に対する満たされていないニーズがあります。ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜組織(オルガノイド)を高度なRDを用いて眼の網膜下腔に移植すると、何千もの健康な変異のない光受容体を備えた網膜組織シートが得られ、1つの承認されたプロトコルで光受容体変性に関連するほとんど/すべての失明性疾患を治療する可能性があります。動物モデルおよび進行RD患者の網膜下腔への胎児網膜組織の移植は成功裏に開発されているが、倫理的懸念および限られた組織供給のためにルーチン療法として使用できない。大眼遺伝性網膜変性症(IRD)動物モデルは、網膜細胞/組織を網膜下腔に移植するための高度な外科的アプローチを利用した視力回復療法の開発に価値があります。地球規模と視細胞分布の類似性(例えば、黄斑様領域 の中心の存在)と、ヒトIRDを厳密に再現するIRDモデルの入手可能性は、有望な治療法の臨床への迅速な翻訳を促進するでしょう。ここでは、hPSC由来の網膜組織を大型動物モデルの網膜下腔に移植する外科的手法を紹介し、動物モデルにおけるこの有望なアプローチの評価を可能にします。
Introduction
世界中の何百万人もの人々が網膜変性症(RD)の影響を受けており、その結果、光感知光受容体(PR)の喪失に関連する視覚障害または失明が生じています。加齢黄斑変性症(AMD)は、遺伝的危険因子と環境/ライフスタイル要因の組み合わせに起因する失明の主な原因です。さらに、200を超える遺伝子と遺伝子座が遺伝性RD(IRD)1を引き起こすことがわかっています。最も一般的なIRDである網膜色素変性症(RP)は遺伝的に不均一であり、約70の遺伝子で3,000を超える遺伝子変異が報告されています2,3,4。小児期に失明を引き起こすレーバー先天性アマウロシス(LCA)も遺伝的に異因性です5,6。遺伝子増強療法が開発され、少数のIRDを治療するための臨床試験が行われています3,7。ただし、IRDの異なる遺伝的形態ごとに治療し、それによって患者のごく一部のみを治療するために、個別の治療法を開発する必要があります。さらに、遺伝子増強は、救助可能な光受容体の集団の存在に依存しているため、進行した変性には適用できません。
したがって、進行性RDおよび重度の終末期失明に対処および治療する治療法の開発には、緊急でありながら満たされていない臨床的ニーズがあります。過去20年間、神経補綴インプラントは、人間が使用する前に、猫などの大型動物モデルで開発およびテストされてきました8,9,10,11,12,13,14。同様に、過去20年間で、網膜下に移植された胚性または成熟した哺乳類の網膜のシートを利用した網膜補充療法が開発され15,16,17,18,19,20,21,22、RD患者でも成功裏に試験されています23,24,25.どちらのアプローチも、新しいセンサー(神経補綴デバイスの場合は光起電力シリコンフォトダイオード26,27、網膜シート移植の場合はシートに編成された健康な突然変異のない光受容体)を変性PRの網膜に導入するというアイデアを利用しています。最近の研究では、ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜前駆細胞28,29、hPSC光受容体30、hPSC-網膜オルガノイド31,32,33の移植などの幹細胞ベースのアプローチの使用が調査されています。網膜オルガノイドは、ディッシュ内での網膜組織の形成と、発達中のヒト胎児網膜の光受容体層に似た数千の突然変異のないPRを有する光受容体シートの誘導を可能にします34,35,36,37,38,39,40.hPSC由来の網膜組織(オルガノイド)をRD状態の患者の網膜下腔に移植することは、新しく有望な治験細胞療法アプローチの1つであり、多くのチームによって追求されています31、32、41、42。(若い光受容体または網膜前駆細胞の)細胞懸濁液の移植と比較して、胎児の光受容体の移植シートは、臨床試験で視力の改善をもたらすことが実証されました23,24。
ここで提示されたプロトコルは、移植片の生存率を高め、シートの保存を改善するために、PRを備えた無傷の網膜シートを導入するための潜在的により良い方法として、網膜オルガノイド全体(オルガノイドリム33,41ではなく)の網膜下送達のための移植手順を詳細に説明しています。ヒト網膜の平らな部分とRPEパッチを導入するための手順が開発されていますが43、44、45、より大きな3D移植片の移植は調査されていません。幹細胞由来の網膜オルガノイドは、視力回復技術を開発するための光受容体シートの無尽蔵の供給源を提供し、倫理的制限がなく、進行性RDおよび終末失明の治療に焦点を当てた治療のためのヒト網膜組織の優れた供給源と考えられています46。宿主の網膜ニッチ(神経網膜、網膜色素上皮、網膜および脈絡膜血管系)への損傷を最小限に抑えて網膜オルガノイドを正確に網膜下移植するための外科的方法の開発は、そのような治療を臨床応用に向けて進めるための重要なステップの1つです31,32。ネコ、イヌ、ブタ、サルなどの大型動物モデルは、外科的送達方法を調査するための優れたモデルであることが証明されており、移植された組織シート(網膜色素上皮(RPE)細胞)の安全性を実証し、オルガノイドの使用を調査しています41、44、45、47、48、49、50.大きな動物の目は、人間の黄斑6,51,52に似た錐体(領域中心)を含む高い光受容体密度の領域の存在を含む、人間と同様の地球サイズと類似の解剖学的構造を持っています。
本稿では、ネコ大型動物モデル(野生型およびCrxRdy/+ネコ)の網膜下腔にhPSC由来の網膜組織(オルガノイド)を移植する技術について述べており、有望な有効性の結果32,53とともに、RD状態を治療するための臨床応用に向けたそのような治験療法のさらなる開発の基礎を構築します。
Protocol
手順は、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)の声明に準拠して実施されました。それらはまた、ミシガン州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。この研究では、ミシガン州立大学で飼育されている猫のコロニーからの野生型および CrxRdy/+ 猫を使用しました。動物を12時間:12時間の明暗サイクルで飼育し?…
Representative Results
この手順により、大型眼動物モデルの網膜下腔へのhPSC由来の網膜オルガノイドの移植に成功し、再現性のあるものが可能になります(ここでは、健康な光受容体(PR)を持つ野生型猫と、PRと網膜が変性したCrxRdy/+猫の2つの例を使用して示されています)。図1に示す手順を使用して、hPSC由来の網膜オルガノイドを調製し、オルガノイドが損傷しないよう…
Discussion
hPSC由来の網膜組織(網膜オルガノイド)の網膜下腔への移植は、PR細胞死(重度または末期失明)によって引き起こされる後期網膜変性疾患の視力を回復するための有望な実験的アプローチです。提示されたアプローチは、ヒト胎児網膜組織片の網膜下移植に基づく以前に開発され、首尾よくテストされた実験的療法に基づいています23、24、<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NEI Fast-Track SBIR grant R44-EY027654-01A1 および SBIR grant 3 R44 EY 027654 – 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones は共同 PI です)。著者らは、Janice Querubin氏(MSU RATTS)が、この研究に含まれる動物の麻酔と一般的なケア、および外科的設定と器具の準備/滅菌の支援を手伝ってくれたことに感謝します。著者らは、移植前日にオルガノイドを受け取り、培地に入れるのを手伝ってくれたPaige Winkler博士と、移植当日の助けに感謝したいと思います。著者らはまた、網膜オルガノイドの入念な出荷、荷送人の組み立て、および各出荷後の温度とGストレス記録のダウンロードについて、Randy Garchar氏(LCTX)に感謝しています。この作品は、作家のイゴール・ナソンキンがバイオタイム(現在のリネージュ)に雇われている間に行われました。
Materials
| 0.22 µm pore syringe filter with PES membrane | Cameo | NA | can be found by various suppliers |
| 23G subretinal injector with extendable 41 G cannula | DORC | 1270.EXT | |
| 250 µL hamilton gas tight luer lock syringe | Hamilton | NA | can be found by various suppliers |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | 707G | |
| 6-0/7-0 polyglactin suture | Ethicon | J570G | |
| Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) | Henry Schein Animal Health | NA | can be found by various suppliers |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NA | can be found by various suppliers |
| cSLO + SD-OCT | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+ OCT | |
| Cyclosporine | Novartis | NA | can be found by various suppliers |
| Dexamethasone 2mg/mL (Azium) | Vetone | NA | can be found by various suppliers |
| Doxycyline 25mg/5mL | Cipla | NA | can be found by various suppliers |
| Fatal Plus solution (pentobarnital solution) | Vortech | NA | can be found by various suppliers |
| Gentamicin 20mg/2mL | Hospira | NA | can be found by various suppliers |
| Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing | World Precision Instruments | TW150-4 | |
| Methylprednisolone actetate 40 mg/mL | Pfizer | NA | can be found by various suppliers |
| Microscope | Zeiss | NA | |
| OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) | Sakura | 4583 | |
| Olympic Vac-Pac Size 23 | Natus | NA | can be found by various suppliers |
| Paraformaldehyde 16% solution | EMS | 15719 | |
| Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
| Prednisolone 15mg/5mL | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
| Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) | Zoetis | NA | can be found by various suppliers |
| RetCam II video fundus camera | Clarity Medical Systems | NA | can be found by various suppliers |
| Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) | Bristol -Myers Squibb Company | NA | can be found by various suppliers |
| Tropicamide 1% ophthalmic solution | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
| Vitrectomy 23G port | Alcon | Accurus systems | |
| Vitrectomy machine | Alcon | Accurus systems | |
| Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle | Frimen | FT170206T |
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Citer Cet Article
Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).