고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식
Summary
여기서는 인간 만능줄기세포(hPSC) 유래 망막 조직을 대형 동물 모델의 망막하 공간에 이식하는 수술 기법을 제시합니다.
Abstract
연령 관련 황반변성(AMD), 색소성 망막염(RP) 및 Leber 선천성 무암증(LCA)과 같은 광수용체 손실과 관련된 망막 퇴행성(RD) 상태는 진행성 및 쇠약해지는 시력 상실을 유발합니다. 광수용체가 상실되면 시력을 회복할 수 있는 치료법에 대한 충족되지 않은 요구가 있습니다. 진행된 RD를 사용하여 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 유래 망막 조직(오가노이드)을 눈의 망막하 공간에 이식하면 수천 개의 건강한 돌연변이가 없는 광수용체가 있는 망막 조직 시트가 제공되며 하나의 승인된 프로토콜로 광수용체 변성과 관련된 대부분의/모든 실명 질환을 치료할 수 있는 잠재력이 있습니다. 동물 모델과 진행성 RD를 가진 사람들의 망막하 공간에 태아 망막 조직을 이식하는 것이 성공적으로 개발되었지만 윤리적 문제와 제한된 조직 공급으로 인해 일상적인 치료법으로 사용할 수 없습니다. 큰 눈 유전 망막 변성(IRD) 동물 모델은 망막 세포/조직을 망막하 공간에 이식하기 위한 고급 외과적 접근 방식을 활용하여 시력 회복 요법을 개발하는 데 유용합니다. 지구 크기 및 광수용체 분포(예: 황반 유사 영역 중심의 존재) 의 유사성 및 인간 IRD를 밀접하게 요약하는 IRD 모델의 가용성은 유망한 치료법을 클리닉으로 신속하게 번역하는 것을 용이하게 할 것입니다. 여기에 제시된 것은 hPSC 유래 망막 조직을 대형 동물 모델의 망막하 공간에 이식하는 수술 기술로, 동물 모델에서 이 유망한 접근 방식을 평가할 수 있습니다.
Introduction
전 세계 수백만 명의 사람들이 망막 변성(RD)의 영향을 받아 시각 장애 또는 빛 감지 광수용체(PR)의 손실과 관련된 실명을 경험합니다. 연령 관련 황반변성(AMD)은 유전적 위험 요인과 환경/생활 습관 요인의 조합으로 인한 실명의 주요 원인입니다. 또한 200개 이상의 유전자와 유전자좌가 유전된 RD(IRD)1을 유발하는 것으로 밝혀졌습니다. 가장 흔한 IRD인 색소성 망막염(RP)은 유전적으로 이질적이며 약 70개의 유전자에서 3,000개 이상의 유전적 돌연변이가 보고되고 있습니다 2,3,4. 어린 시절에 실명을 유발하는 Leber 선천성 Amaurosis(LCA)도 유전적으로 이질적입니다 5,6. 유전자 확대 요법이 개발되어 소수의 IRD를 치료하기 위한 임상 시험 중에 있다 3,7. 그러나 IRD의 각 뚜렷한 유전적 형태를 치료하고 따라서 소수의 환자만을 치료하기 위해 별도의 치료법을 개발해야 합니다. 또한, 유전자 증강은 구출 가능한 광수용체 집단의 존재에 의존하므로 진행된 변성에는 적용할 수 없습니다.
따라서 진행성 RD와 중증에서 말기 실명을 다루고 치료하는 치료법 개발에 대한 시급하지만 아직 충족되지 않은 임상적 요구가 있습니다. 지난 2 년 동안 신경 인공 임플란트는 인간이 사용하기 전에 고양이와 같은 대형 동물 모델에서 개발되고 테스트되었습니다 8,9,10,11,12,13,14. 마찬가지로, 지난 20년 동안 망막하로 이식된 배아 또는 성숙한 포유류 망막 시트를 활용하는 망막 대체 요법이 개발되었으며 15,16,17,18,19,20,21,22 RD 환자에서도 성공적으로 테스트되었습니다 23,24,25. 두 접근 방식 모두 새로운 센서(신경 보철 장치의 경우 광전지 실리콘 포토다이오드26,27, 망막 시트 이식의 경우 시트로 구성된 건강한 돌연변이 없는 광수용체)를 퇴행성 PR이 있는 망막에 도입하는 아이디어를 활용합니다. 최근 연구에서는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 유래 망막 전구체28,29, hPSC-광수용체 30 및 hPSC-망막 오가노이드31,32,33의 이식과 같은 줄기 세포 기반 접근법의 사용을 조사했습니다. 망막 오가노이드는 접시에서 망막 조직의 형성을 가능하게 하고 발달 중인 인간 태아 망막의 광수용체 층과 유사한 수천 개의 돌연변이가 없는 PR을 가진 광수용체 시트의 유도를 가능하게 합니다 34,35,36,37,38,39,40. RD 질환 환자의 망막하 공간에 hPSC 유래 망막 조직(오가노이드)을 이식하는 것은 새롭고 유망한 연구용 세포 치료 접근법 중 하나이며 여러 팀(31,32,41,42)에서 추구하고 있습니다. 세포 현탁액(어린 광수용체 또는 망막 전구체)의 이식과 비교하여, 태아 광수용체의 이식 시트는 임상 시험에서 시력 개선을 가져오는 것으로 입증되었습니다23,24.
여기에 제시된 프로토콜은 PR이 있는 온전한 망막 시트를 도입하고 이식편 생존을 증가시키고 시트 보존을 개선하는 잠재적으로 더 나은 방법으로서 전체 망막 오가노이드(오가노이드 테두리33,41이 아닌)의 망막하 전달을 위한 이식 절차를 자세히 설명합니다. 인간 망막의 평평한 조각과 RPE 패치를 도입하는 절차가 개발되었지만43,44,45, 더 큰 3D 이식편의 이식은 조사되지 않았습니다. 줄기 세포 유래 망막 오가노이드는 시력 회복 기술 개발을 위한 광수용체 시트의 무궁무진한 공급원을 제공하고, 윤리적 제한이 없으며, 진행성 RD 및 말기 실명 치료에 중점을 둔 치료법을 위한 인간 망막 조직의 훌륭한 공급원으로 간주됩니다46. 숙주 망막 틈새(신경 망막, 망막 색소 상피 및 망막 및 맥락막 혈관 구조)에 대한 손상을 최소화하면서 망막 오가노이드의 정확한 망막하 이식을 위한 수술 방법의 개발은 이러한 치료법을 임상 적용으로 발전시키기 위한 중요한 단계 중 하나입니다31,32. 고양이, 개, 돼지, 원숭이와 같은 대형 동물 모델은 외과적 전달 방법을 조사하고 이식된 조직 시트(망막 색소 상피(RPE) 세포)의 안전성을 입증하고 오가노이드 41,44,45,47,48,49,50의 사용을 조사하는 데 좋은 모델임이 입증되었습니다. 큰 동물의 눈은 인간의 황반과 유사한 원뿔(중앙 영역)을 포함하여 광수용체 밀도가 높은 영역의 존재를 포함하여 인간과 유사한 지구 크기뿐만 아니라 유사한 해부학적 구조를 가지고 있습니다 6,51,52.
이 원고에서는 hPSC 유래 망막 조직(오가노이드)을 고양이과 대형 동물 모델(야생형 및 CrxRdy/+ 고양이 모두)의 망막하 공간에 이식하는 기술을 설명하며, 이는 유망한 효능 결과와 함께32,53 RD 상태를 치료하기 위한 임상 적용에 대한 이러한 연구 요법의 추가 개발을 위한 기반을 구축합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
hPSC 유래 망막 조직(망막 오가노이드)을 망막하 공간에 이식하는 것은 PR 세포 사멸(심도 또는 말기 실명)로 인한 말기 망막 퇴행성 질환의 시력 회복을 위한 유망한 실험적 접근 방식입니다. 제시된 접근법은 인간 태아 망막 조직 23,24,25 조각의 망막하 이식을 기반으로 이전에 개발되고 성공적으로 테스트된 실험적 치료법을 기…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NEI Fast-track SBIR 보조금 R44-EY027654-01A1 및 SBIR 보조금 3 R44 EY 027654 – 02 S1(I.O.N., Lineage Cell Therapeutics, Dr. Petersen-Jones는 공동 PI)의 지원을 받았습니다. 저자는 이 연구에 포함된 동물에 대한 마취 및 일반적인 관리와 수술 환경 및 기구 준비/살균에 도움을 준 Ms. Janice Querubin(MSU RATTS)에게 감사드립니다. 저자는 이식 전날 오가노이드를 받아 배지에 삽입하는 데 도움을 준 Paige Winkler 박사와 이식 당일에 도움을 준 Paige Winkler 박사에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 망막 오가노이드의 부지런한 배송, 배송업체 조립, 각 배송 후 온도 및 G-스트레스 기록 다운로드에 대해 Mr. Randy Garchar(LCTX)에게 감사드립니다. 이 작업은 작가 Igor Nasonkin이 Biotime(현재 Lineage)에 고용되어 있는 동안 수행되었습니다.
Materials
| 0.22 µm pore syringe filter with PES membrane | Cameo | NA | can be found by various suppliers |
| 23G subretinal injector with extendable 41 G cannula | DORC | 1270.EXT | |
| 250 µL hamilton gas tight luer lock syringe | Hamilton | NA | can be found by various suppliers |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | 707G | |
| 6-0/7-0 polyglactin suture | Ethicon | J570G | |
| Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) | Henry Schein Animal Health | NA | can be found by various suppliers |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NA | can be found by various suppliers |
| cSLO + SD-OCT | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+ OCT | |
| Cyclosporine | Novartis | NA | can be found by various suppliers |
| Dexamethasone 2mg/mL (Azium) | Vetone | NA | can be found by various suppliers |
| Doxycyline 25mg/5mL | Cipla | NA | can be found by various suppliers |
| Fatal Plus solution (pentobarnital solution) | Vortech | NA | can be found by various suppliers |
| Gentamicin 20mg/2mL | Hospira | NA | can be found by various suppliers |
| Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing | World Precision Instruments | TW150-4 | |
| Methylprednisolone actetate 40 mg/mL | Pfizer | NA | can be found by various suppliers |
| Microscope | Zeiss | NA | |
| OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) | Sakura | 4583 | |
| Olympic Vac-Pac Size 23 | Natus | NA | can be found by various suppliers |
| Paraformaldehyde 16% solution | EMS | 15719 | |
| Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
| Prednisolone 15mg/5mL | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
| Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) | Zoetis | NA | can be found by various suppliers |
| RetCam II video fundus camera | Clarity Medical Systems | NA | can be found by various suppliers |
| Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) | Bristol -Myers Squibb Company | NA | can be found by various suppliers |
| Tropicamide 1% ophthalmic solution | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
| Vitrectomy 23G port | Alcon | Accurus systems | |
| Vitrectomy machine | Alcon | Accurus systems | |
| Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle | Frimen | FT170206T |
References
- Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
- Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
- Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
- Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229 (2013).
- Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
- Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
- Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
- Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
- Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
- Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
- Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
- Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
- Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
- Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
- Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
- Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943 (2011).
- Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
- Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
- Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
- Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
- Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
- Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30 (2019).
- Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
- Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
- Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
- Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
- Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
- Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
- Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
- Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
- Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
- Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
- Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475 (2019).
- Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
- Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
- Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
- Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
- Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390 (2014).
- Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109 (2019).
- Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
- Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
- Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
- Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
- O’Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
- Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
- Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
- Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
- Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
- Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber’s Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).
