Presentert her er en kirurgisk teknikk for transplantasjon av humant pluripotent stamcelle (hPSC) -avledet retinalt vev inn i det subretinale rommet til en stor dyremodell.
Retinal degenerative (RD) forhold assosiert med fotoreceptortap som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), retinitis pigmentosa (RP) og Leber medfødt amaurose (LCA) forårsaker progressivt og svekkende synstap. Det er et udekket behov for terapier som kan gjenopprette syn når fotoreceptorer har gått tapt. Transplantasjon av humant pluripotent stamcelle (hPSC) -avledet retinalvev (organoider) inn i det subretinale rommet i et øye med avansert RD bringer retinale vevsark med tusenvis av sunne mutasjonsfrie fotoreceptorer og har potensial til å behandle de fleste / alle blindende sykdommer forbundet med fotoreceptordegenerasjon med en godkjent protokoll. Transplantasjon av føtal retinalvev i det subretinale rommet til dyremodeller og personer med avansert RD har blitt utviklet vellykket, men kan ikke brukes som rutinemessig terapi på grunn av etiske bekymringer og begrenset vevsforsyning. Store øyearvelige retinal degenerasjon (IRD) dyremodeller er verdifulle for å utvikle visjonsrestaureringsterapier ved hjelp av avanserte kirurgiske tilnærminger for å transplantere retinale celler / vev inn i subretinalrommet. Likhetene i klodestørrelse og fotoreseptorfordeling (f.eks. Tilstedeværelse av makulalignende regionområde centralis) og tilgjengeligheten av IRD-modeller som nøye rekapitulerer human IRD, vil lette rask oversettelse av en lovende terapi til klinikken. Presentert her er en kirurgisk teknikk for transplantasjon av hPSC-avledet retinalvev i subretinalrommet til en stor dyremodell som tillater vurdering av denne lovende tilnærmingen i dyremodeller.
Millioner av mennesker rundt om i verden er påvirket av retinal degenerasjon (RD) med resulterende synshemming eller blindhet forbundet med tap av lysfølsomme fotoreceptorer (PR). Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er en viktig årsak til blindhet som følge av en kombinasjon av genetiske risikofaktorer og miljø- / livsstilsfaktorer. I tillegg har over 200 gener og loci blitt funnet å forårsake arvelig RD (IRD) 1. Retinitis pigmentosa (RP), den vanligste IRD, er genetisk heterogen med mer enn 3000 genetiske mutasjoner i omtrent 70 gener som rapporteres 2,3,4. Leber medfødt amaurose (LCA), som forårsaker blindhet i barndommen, er også genetisk heterogen 5,6. Genforstørrelsesterapi er utviklet og er i kliniske studier for behandling av et lite antall IRDer 3,7. Imidlertid må en separat terapi utvikles for behandling av hver distinkte genetiske form for IRD og dermed bare behandle en liten undergruppe av pasienter. Videre er genforstørrelse avhengig av tilstedeværelsen av en populasjon av redningsbare fotoreceptorer og er derfor ikke anvendelig for avansert degenerasjon.
Det er derfor et presserende og ennå uoppfylt klinisk behov for utvikling av terapier som adresserer og behandler avanserte RDs og dyp til terminal blindhet. I løpet av de siste 2 tiårene har nevroprostetiske implantater blitt utviklet og testet i store dyremodeller, som katten, før menneskelig bruk 8,9,10,11,12,13,14. På samme måte har de siste 20 årene retinal erstatningsterapier som bruker ark av embryonale eller til og med modne pattedyrs retina podet subretinalt, blitt utviklet 15,16,17,18,19,20,21,22 og til og med testet vellykket hos RD-pasienter 23,24,25. Begge tilnærmingene utnytter ideen om å introdusere nye sensorer (fotovoltaiske silisiumfotodioder når det gjelder nevroproteser26,27, og sunne mutasjonsfrie fotoreceptorer organisert i ark, i tilfelle retinalarkimplantasjon) i netthinnen med degenerert PR. Nylige studier har undersøkt bruken av stamcellebaserte tilnærminger som transplantasjon av humane pluripotente stamceller (hPSC) -avledede retinale progenitorer28,29, hPSC-fotoreceptorer 30 og hPSC-retinale organoider31,32,33. Retinale organoider muliggjør dannelse av retinalt vev i en tallerken og derivasjon av fotoreseptorark med tusenvis av mutasjonsfrie PR-er, som ligner fotoreseptorlaget i den utviklende humane føtale netthinnen 34,35,36,37,38,39,40 . Transplantasjon av hPSC-avledet retinalvev (organoider) i det subretinale rommet hos pasienter med RD-tilstander er en av de nye og lovende undersøkelsescelleterapitilnærmingene, som forfølges av en rekke lag31,32,41,42. Sammenlignet med transplantasjon av cellesuspensjonen (av unge fotoreceptorer eller retinale progenitorer), ble transplanterte ark av føtale fotoreceptorer vist å resultere i synforbedringer i kliniske studier23,24.
Protokollen som presenteres her beskriver i detalj en transplantasjonsprosedyre for subretinal levering av hele retinale organoider (i stedet for organoide felger33,41) som en potensielt bedre måte å introdusere intakte retinalark med PR, for å øke transplantatoverlevelsen og forbedre arkbevaringen. Selv om prosedyrer for å introdusere et flatt stykke menneskelig retina og også RPE-patcher har blitt utviklet43,44,45, har transplantasjon av større 3D-transplantater ikke blitt undersøkt. Stamcelleavledede retinale organoider gir en uuttømmelig kilde til fotoreceptorark for å utvikle visjonsgjenopprettingsteknologier, er fri for etisk begrensning, og regnes som en utmerket kilde til humant retinalvev for terapier fokusert på behandling av avansert RD og terminal blindhet46. Utvikling av kirurgiske metoder for presis subretinal implantasjon av retinale organoider med minimal skade på vertsretinal nisje (nevral retina, retinalt pigmentepitel og retinal og koroidal vaskulatur) er et av de kritiske trinnene for å fremme slik behandling mot kliniske anvendelser31,32. Store dyremodeller som katter, hunder, griser og aper har vist seg å være gode modeller for å undersøke kirurgiske leveringsmetoder, samt å demonstrere sikkerheten til implanterte ark av vev (retinal pigmentepitel (RPE) celler) og undersøke bruken av organoider 41,44,45,47,48,49,50 . Det store dyreøyet har en lignende klodestørrelse som menneskelig, så vel som lignende anatomi, inkludert tilstedeværelsen av et område med høy fotoreseptortetthet, inkludert kjegler (området centralis), som ligner den menneskelige makulaen 6,51,52.
I dette manuskriptet beskrives en teknikk for implantasjon av hPSC-avledet retinalt vev (organoider) i det subretinale rommet til store kattemodeller (både villtype og CrxRdy/+ katter), som sammen med lovende effektresultater32,53 bygger et grunnlag for videreutvikling av slik undersøkelsesterapi mot kliniske anvendelser for å behandle RD-tilstander.
Implantasjon av hPSC-avledet retinalvev (retinale organoider) i det subretinale rommet er en lovende eksperimentell tilnærming for å gjenopprette visjon for sent stadium retinal degenerative sykdommer forårsaket av PR-celledød (dyp eller terminal blindhet). Den presenterte tilnærmingen bygger på en tidligere utviklet og vellykket testet eksperimentell terapi basert på subretinal poding av et stykke humant føtalt retinalvev23,24,25<sup class="xr…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av NEI Fast-track SBIR grant R44-EY027654-01A1 og SBIR grant 3 R44 EY 027654 – 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones er en co-PI). Forfatterne vil gjerne takke Janice Querubin (MSU RATTS) for hennes hjelp med anestesi og generell omsorg for dyrene som er inkludert i denne studien, samt hjelp med kirurgisk setting og instrumentforberedelse / sterilisering. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Paige Winkler for hjelpen med å motta organoider og plassere dem i media dagen før implantasjonen og for hjelpen på implantasjonsdagen. Forfatterne er også takknemlige for Mr. Randy Garchar (LCTX) for flittig forsendelse av retinale organoider, montering av avsenderen og nedlasting av temperatur og G-stress-poster etter hver forsendelse. Dette arbeidet ble utført mens forfatteren Igor Nasonkin var ansatt i Biotime (nå Lineage).
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane | Cameo | NA | can be found by various suppliers |
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula | DORC | 1270.EXT | |
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe | Hamilton | NA | can be found by various suppliers |
6-0 Silk suture | Ethicon | 707G | |
6-0/7-0 polyglactin suture | Ethicon | J570G | |
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) | Henry Schein Animal Health | NA | can be found by various suppliers |
Buprenorphine 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NA | can be found by various suppliers |
cSLO + SD-OCT | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+ OCT | |
Cyclosporine | Novartis | NA | can be found by various suppliers |
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) | Vetone | NA | can be found by various suppliers |
Doxycyline 25mg/5mL | Cipla | NA | can be found by various suppliers |
Fatal Plus solution (pentobarnital solution) | Vortech | NA | can be found by various suppliers |
Gentamicin 20mg/2mL | Hospira | NA | can be found by various suppliers |
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing | World Precision Instruments | TW150-4 | |
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL | Pfizer | NA | can be found by various suppliers |
Microscope | Zeiss | NA | |
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) | Sakura | 4583 | |
Olympic Vac-Pac Size 23 | Natus | NA | can be found by various suppliers |
Paraformaldehyde 16% solution | EMS | 15719 | |
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
Prednisolone 15mg/5mL | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) | Zoetis | NA | can be found by various suppliers |
RetCam II video fundus camera | Clarity Medical Systems | NA | can be found by various suppliers |
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) | Bristol -Myers Squibb Company | NA | can be found by various suppliers |
Tropicamide 1% ophthalmic solution | Akorn | NA | can be found by various suppliers |
Vitrectomy 23G port | Alcon | Accurus systems | |
Vitrectomy machine | Alcon | Accurus systems | |
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle | Frimen | FT170206T |