Transplante Sub-Retiniano de Tecido Retiniano Derivado de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Modelo Animal de Grande Porte Felino

Summary

Apresentamos aqui uma técnica cirúrgica para transplante de tecido retiniano derivado de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) no espaço sub-retiniano de um modelo animal de grande porte.

Abstract

Condições degenerativas retinianas (DR) associadas à perda de fotorreceptores, como degeneração macular relacionada à idade (DMRI), retinose pigmentar (RP) e amaurose congênita de Leber (LCA), causam perda progressiva e debilitante da visão. Há uma necessidade não atendida de terapias que possam restaurar a visão uma vez que os fotorreceptores tenham sido perdidos. O transplante de tecido da retina derivado de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) (organoides) no espaço sub-retiniano de um olho com DR avançada traz folhas de tecido da retina com milhares de fotorreceptores saudáveis livres de mutação e tem um potencial para tratar a maioria/todas as doenças cegantes associadas à degeneração de fotorreceptores com um protocolo aprovado. O transplante de tecido retiniano fetal para o espaço sub-retiniano de modelos animais e pessoas com DR avançada foi desenvolvido com sucesso, mas não pode ser usado como terapia de rotina devido a preocupações éticas e suprimento limitado de tecidos. Modelos animais de degeneração retiniana hereditária de grandes olhos (IRD) são valiosos para o desenvolvimento de terapias de restauração da visão utilizando abordagens cirúrgicas avançadas para transplantar células/tecidos da retina para o espaço sub-retiniano. As semelhanças no tamanho do globo e na distribuição dos fotorreceptores (por exemplo, presença de área central da região semelhante à mácula) e a disponibilidade de modelos de IRD recapitulando de perto o IRD humano facilitariam a rápida tradução de uma terapia promissora para a clínica. Apresenta-se aqui uma técnica cirúrgica de transplante de tecido retiniano derivado de hPSC para o espaço sub-retiniano de um modelo animal de grande porte, permitindo avaliar esta abordagem promissora em modelos animais.

Introduction

Milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas pela degeneração retiniana (DR) com consequente deficiência visual ou cegueira associada à perda dos fotorreceptores (RPs) sensíveis à luz. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma das principais causas de cegueira resultante de uma combinação de fatores de risco genéticos e fatores ambientais/estilo de vida. Além disso, mais de 200 genes e loci causaram DR hereditária (IRD)¹. A retinose pigmentar (PR), a mais comum DIR, é geneticamente heterogênea, com mais de 3.000 mutações genéticas em aproximadamente 70 genes relatadas2,3,4. A Amaurose Congênita de Leber (LAC), que causa cegueira na infância, também é geneticamente heterogênea5,6. A terapia de aumento gênico foi desenvolvida e está em ensaios clínicos para o tratamento de um pequeno número de IRDs ^3,7. No entanto, uma terapia separada deve ser desenvolvida para o tratamento de cada forma genética distinta de IRD e, assim, tratar apenas um pequeno subgrupo de pacientes. Além disso, o aumento gênico depende da presença de uma população de fotorreceptores resgatáveis e, portanto, não é aplicável para degeneração avançada.

Há, portanto, uma necessidade clínica urgente e ainda não atendida para o desenvolvimento de terapias que abordem e tratem as DRs avançadas e a cegueira profunda a terminal. Nas últimas 2 décadas implantes neuroprotéticos foram desenvolvidos e testados em modelos animais de grande porte, como o gato, antes do uso humano 8,9,10,11,12,13,14. Da mesma forma, nos últimos 20 anos, terapias de reposição retiniana utilizando lâminas de retina de mamíferos embrionárias ou mesmo maduras enxertadas sub-retinicamente foram desenvolvidas 15,16,17,18,19,20,21,22 e até testadas com sucesso em pacientes com DR ^23,24,25. Ambas as abordagens utilizam a ideia de introduzir novos sensores (fotodiodos fotovoltaicos de silício, no caso de dispositivos neuroprotéticos26,27, e fotorreceptores saudáveis livres de mutação organizados em folhas^, no caso de implantação de folhas de retina) em retinas com RPs degenerados. Estudos recentes têm investigado o uso de abordagens baseadas em células-tronco, como o transplante de progenitores retinianos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)^28,29, fotorreceptores hPSC 30 e organoides retinianos hPSC^31,32,33. Os organoides da retina permitem a formação de tecido retiniano em uma placa e derivação de folhas fotorreceptoras com milhares de RPs livres de mutação, que se assemelham à camada fotorreceptora da retina fetal humana em desenvolvimento 34,35,36,37,38,39,40 . O transplante de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides) para o espaço sub-retiniano de pacientes com DR é uma das novas e promissoras abordagens de terapia celular investigativa, sendo perseguida por várias equipes31,32,41,42. Em comparação com o transplante da suspensão celular (de fotorreceptores jovens ou progenitores da retina), folhas transplantadas de fotorreceptores fetais demonstraram resultar em melhora da visão em ensaios clínicos^23,24.

O protocolo aqui apresentado descreve, em detalhes, um procedimento de transplante para liberação sub-retiniana de organoides da retina inteira (em vez de bordas organoides33,41) como uma maneira potencialmente melhor de introduzir lâminas retinianas intactas com RPs^, para aumentar a sobrevida do enxerto e melhorar a preservação do lençol. Embora procedimentos para introdução de um pedaço plano de retina humana e também de placas de EPR tenham sido desenvolvidos^43,44,45, o transplante de enxertos 3D maiores ainda não foi investigado. Os organoides da retina derivados de células-tronco fornecem uma fonte inesgotável de folhas fotorreceptoras para o desenvolvimento de tecnologias de restauração da visão, são livres de restrições éticas e são considerados uma excelente fonte de tecido retiniano humano para terapias focadas no tratamento da DR avançada e cegueira terminal⁴⁶. O desenvolvimento de métodos cirúrgicos para implante sub-retiniano preciso de organoides da retina com mínima lesão do nicho retiniano do hospedeiro (retina neural, epitélio pigmentado da retina e vasculatura retiniana e coroidal) é um dos passos críticos para o avanço dessa terapia para aplicações^{clínicas31,32}. Modelos animais de grande porte, como gatos, cães, porcos e macacos, têm se mostrado bons modelos para investigar métodos de parto cirúrgico, bem como para demonstrar a segurança de lâminas de tecido implantadas (células do epitélio pigmentado da retina (EPR)) e investigar o uso de organoides 41,44,45,47,48,49,50 . O olho do grande animal tem tamanho de globo semelhante ao humano, bem como anatomia semelhante, incluindo a presença de uma região de alta densidade de fotorreceptores, incluindo cones (a área central), assemelhando-se à mácula humana 6,51,52.

Neste manuscrito, é descrita uma técnica para a implantação de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides) no espaço sub-retiniano de modelos de animais grandes felinos (gatos selvagens e Crx^Rdy/+) que, juntamente com resultados promissores de eficácia32,53, constrói uma base para o desenvolvimento posterior dessa terapia experimental em direção a aplicações clínicas no tratamento de condições de DR.

Protocol

Os procedimentos foram conduzidos de acordo com a declaração da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e da Visão. Eles também foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Michigan. Gatos selvagens e CrxRdy/+ de uma colônia de gatos mantida na Michigan State University foram usados neste estudo. Os animais foram alojados sob ciclos claro-escuro de 12 h : 12 h e alime…

Representative Results

Este procedimento permite a implantação bem-sucedida e reprodutível de organoides da retina derivados de hPSC no espaço sub-retiniano de um modelo animal de olho grande (demonstrado aqui usando 2 exemplos: gatos selvagens com fotorreceptores (RPs) saudáveis e gatos CrxRdy/+ com RPs e retina degeneradas). Usando as etapas indicadas na Figura 1 , prepare e carregue os organoides da retina derivados da hPSC na cânula de vidro borossilicato do dispositivo de in…

Discussion

A implantação de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides da retina) no espaço sub-retiniano é uma abordagem experimental promissora para restaurar a visão para doenças degenerativas retinianas em estágio avançado causadas por morte celular PR (cegueira profunda ou terminal). A abordagem apresentada baseia-se em uma terapia experimental previamente desenvolvida e testada com sucesso, baseada no enxerto sub-retiniano de um pedaço de tecido retiniano fetal humano^23,24,25<sup…

Materials

0.22 µm pore syringe filter with PES membrane	Cameo	NA	can be found by various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula	DORC	1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe	Hamilton	NA	can be found by various suppliers
6-0 Silk suture	Ethicon	707G
6-0/7-0 polyglactin suture	Ethicon	J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject)	Henry Schein Animal Health	NA	can be found by various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Par Pharmaceutical	NA	can be found by various suppliers
cSLO + SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine	Novartis	NA	can be found by various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium)	Vetone	NA	can be found by various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL	Cipla	NA	can be found by various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarnital solution)	Vortech	NA	can be found by various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL	Hospira	NA	can be found by various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing	World Precision Instruments	TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL	Pfizer	NA	can be found by various suppliers
Microscope	Zeiss	NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)	Sakura	4583
Olympic Vac-Pac Size 23	Natus	NA	can be found by various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution	EMS	15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)	Zoetis	NA	can be found by various suppliers
RetCam II video fundus camera	Clarity Medical Systems	NA	can be found by various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40)	Bristol -Myers Squibb Company	NA	can be found by various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution	Akorn	NA	can be found by various suppliers
Vitrectomy 23G port	Alcon	Accurus systems
Vitrectomy machine	Alcon	Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle	Frimen	FT170206T