Pankreas suyu, insan pankreas kanseri için değerli bir biyobelirteç kaynağıdır. Burada intraoperatif toplama prosedürü için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu prosedürü murin modellerinde benimseme zorluğunun üstesinden gelmek için, alternatif bir örnek, tümör interstisyel sıvısı öneriyoruz ve burada izolasyonu için iki protokol açıklıyoruz.
Pankreatik adenokarsinom (PDAC), kansere bağlı ölümlerin dördüncü önde gelen nedenidir ve yakında ikinci olacaktır. Preoperatif ayırıcı tanıya ve hasta profillemesine yardımcı olmak için spesifik pankreas patolojileriyle ilişkili değişkenlere acil ihtiyaç vardır. Pankreas suyu, tümör bölgesine yakınlığı nedeniyle çevredeki dokudaki değişiklikleri yansıtan nispeten keşfedilmemiş bir vücut sıvısıdır. Burada intraoperatif toplama prosedürünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ne yazık ki, mekanik çalışmalar yapmak için pankreas suyu koleksiyonunu PDAC’nin murin modellerine çevirmek teknik olarak çok zordur. Tümör interstisyel sıvısı (TIF), tümör ve stromal hücreleri yıkayan kan ve plazma dışındaki hücre dışı sıvıdır. Pankreas suyuna benzer şekilde, plazmada seyreltilmiş olarak bulunan molekülleri toplama ve konsantre etme özelliği nedeniyle, TIF, mikro çevresel değişikliklerin bir göstergesi ve hastalıkla ilişkili biyobelirteçlerin değerli bir kaynağı olarak kullanılabilir. TIF’ye kolayca erişilemediğinden, izolasyonu için çeşitli teknikler önerilmiştir. Burada izolasyonu için iki basit ve teknik olarak iddiasız yöntem açıklıyoruz: doku santrifüjleme ve doku elüsyonu.
Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) en agresif tümörlerden biridir ve kısa sürede ikinci önde gelen ölüm nedeni haline gelecektir 1,2,3. İmmünsüpresif mikro çevresi ve immünoterapi protokollerine yanıt vermemesi ile bilinir4. Günümüzde cerrahi rezeksiyon PDAC için hala tek küratif seçenektir, ancak erken nüks ve cerrahi sonrası komplikasyonların yüksek sıklığı vardır. İleri bir aşamaya kadar spesifik semptomların olmaması, erken tanıya izin vermez ve hastalığın son tarihlerine katkıda bulunur. Ayrıca, PDAC ve diğer benign pankreas patolojileri arasındaki semptomların örtüşmesi, mevcut tanı stratejileri ile hızlı ve güvenilir bir tanı konmasını engelleyebilir. Spesifik pankreas patolojileri ile ilişkili değişkenlerin tanımlanması, cerrahi karar verme sürecini kolaylaştırabilir ve hasta profillemesini iyileştirebilir.
Biyobelirteç keşfinde umut verici sonuçlar, kan5,6,7, idrar8, tükürük9 ve pankreas suyu10,11,12 gibi kolay erişilebilir vücut sıvıları kullanılarak elde edilmiştir. Birçok çalışma, PDAC ve diğer iyi huylu pankreas rahatsızlıkları arasında ayrım yapabilecek aday molekülleri veya imzaları tanımlamak için genomik, proteomik ve metabolomik teknikler gibi kapsamlı “omik” yaklaşımlardan yararlanmıştır. Son zamanlarda, nispeten keşfedilmemiş bir vücut sıvısı olan pankreas suyunun, farklı klinik profillere sahip hastaların metabolik imzalarını tanımlamak için kullanılabileceğini gösterdik12. Pankreas suyu, pankreas duktal hücrelerinin sekretomunu biriktiren ve ana pankreas kanalına ve daha sonra ana ortak safra kanalına akan protein bakımından zengin bir sıvıdır. Pankreasa yakınlığı nedeniyle, tümör kütlesinin neden olduğu mikro çevresel pertürbasyonlardan güçlü bir şekilde etkilenebilir (Şekil 1) ve bu nedenle kan veya idrardan veya doku bazlı profillemeden daha bilgilendiricidir. Birçok çalışma, sitolojik analiz 13, kütle-spektrometri14,15 tarafından gerçekleştirilen proteomik analiz, K-ras ve p53 mutasyonları gibi genetik ve epigenetik belirteçlerin değerlendirilmesi 16,17, DNA metilasyonundaki değişiklikler 18 ve miRNA’lar 19 dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanarak pankreas suyunun hastalığın yeni biyobelirteçlerini tanımlama potansiyelini araştırmıştır. . Teknik olarak, pankreas suyu intraoperatif olarak veya endoskopik ultrason, retrograd kolanjiyo-pankreatografi gibi minimal invaziv prosedürlerle veya duodenal meyve suyu sekresyonu20’nin endoskopik toplanmasıyla toplanabilir. Kullanılan toplama tekniğinden pankreas suyu bileşiminin ne ölçüde etkilendiği henüz belli değildir. Burada intraoperatif toplama prosedürünü açıklıyoruz ve pankreas suyunun PDAC biyobelirteçleri için değerli bir kaynak olabileceğini gösteriyoruz.
Şekil 1: Pankreas suyu koleksiyonunun şematik gösterimi. (A) Pankreas suyunun pankreas kanalına salgılanmasını ve ameliyat sırasında toplanmasını gösteren şematik gösterim. İç kısım, tümör mikro ortamının yakın çekimini gösterir: pankreas suyu, pankreas kanallarındaki tümör ve stromal hücreler tarafından salınan molekülleri toplar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
PDAC’nin genetik ve ortotopik fare modellerinde pankreas suyunun toplanması, bu biyoakışkanın klinik öncesi mekanik çalışmalarda kullanılması perspektifinde takdir edilecektir; Bununla birlikte, bu prosedür teknik olarak çok zor olabilir ve deri altı tümörler gibi daha basit modeller için uygun değildir. Bu nedenle, tümör interstisyel sıvısını (TIF), çevredeki pertürbasyonların bir göstergesi olarak hareket etme özelliğine benzer özelliği nedeniyle, pankreas suyuna alternatif bir kaynak olarak tanımladık. İnterstisyel sıvı (IF), kan ve lenfatik damarların dışında bulunan, doku hücrelerini yıkayan hücre dışı sıvıdır21. IF bileşimi hem organa kan dolaşımından hem de lokal sekresyondan etkilenirse; Aslında, çevreleyen hücreler aktif olarak IF21’de protein üretir ve salgılar. İnterstisyum, çevredeki dokuların mikro çevresel değişikliklerini yansıtır ve bu nedenle tümörler gibi çeşitli patolojik bağlamlarda biyobelirteç keşfi için değerli bir kaynak olabilir. TIF’deki lokal olarak salgılanan proteinlerin yüksek konsantrasyonu, plazmada prognostik veya tanısal biyobelirteçler olarak test edilecek aday molekülleri tanımlamak için kullanılabilir22,23,24. Birçok çalışma, TIF’nin kütle spektrometri teknikleri23,24,25, multipleks ELISA yaklaşımları 26 ve mikroRNA profilleme27 gibi yüksek verimli proteomik yaklaşımlar için uygun bir örnek olduğunu kanıtlamıştır.
Tümörlerde IF’nin izolasyonu için, in vivo (kılcal ultrafiltrasyon 28,29,30,31 ve mikrodiyaliz 32,33,34,35) ve ex vivo yöntemler (doku santrifüjleme22,36,37,38 ve doku elüsyonu 39,40,41,42). Bu teknikler ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir43,44. Uygun yöntemin seçimi, aşağı akış analizleri ve uygulamaları ve kurtarılan hacim gibi konuları dikkate almalıdır. Son zamanlarda bu yaklaşımı, iki murin pankreatik adenokarsinom hücre hattından tümörlerin farklı metabolik aktivitesini göstermek için bir ilke kanıtı olarak kullandık12. Literatür 24,38’e dayanarak, hücre kırılmasını ve hücre içi içerikten seyreltmeyi önlemek için düşük hızlı santrifüjleme yöntemini kullanmayı seçtik. TIF’deki hem glikoz hem de laktat miktarı, iki farklı hücre hattının farklı glikolitik özelliklerini yansıtıyordu. Burada, TIF’nin izolasyonu için en sık kullanılan iki yöntemin protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz: doku santrifüjleme ve doku elüsyonu (Şekil 2).
Şekil 2: Tümör interstisyel sıvı izolasyon yöntemlerinin şematik gösterimi. Protokolde ayrıntılı olarak açıklanan tekniklerin, yani doku santrifüjleme (A) ve doku elüsyonu (B) tekniklerinin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu çalışmada, büyük ölçüde keşfedilmemiş bir sıvı biyopsisi olan pankreas suyunu intraoperatif olarak toplama tekniğini tanımladık. Son zamanlarda pankreas suyunun hastalığın metabolik belirteçlerinin bir kaynağı olarak kullanılabileceğini gösterdik12. Kan 5,6,7, idrar8 ve tükürük9 gibi diğer sıvı biyopsiler üzerinde yapılan metabolomik analizler, P…
The authors have nothing to disclose.
Teknik yardım için Roberta Migliore’ye teşekkür ederiz. Bu sonuçlara yol açan araştırma, IG2016-ID.18443 projesi – P.I. Marchesi Federica kapsamında Associazione Italiana per la ricerca sul cancro’dan (AIRC) fon aldı. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |