항원 태그가 붙은 차단 병변을 사용한 반응체 만남의 시각화
Summary
DNA 부가물과의 복제 포크 충돌은 이중 가닥 절단을 유발할 수 있지만 리플리솜과 차단 병변 사이의 상호 작용에 대해서는 알려진 바가 적습니다. 우리는 이러한 만남을 시각화하고 반응 구성에 대한 결과를 특성화하기 위해 근접 결찰 분석을 사용했습니다.
Abstract
뉴클레아제, 방사선 및 기타 DNA 차단기에 의해 유도된 이중 가닥 절단(DSB)에 대한 세포 반응에 대한 상당한 통찰력이 있습니다. 부분적으로, 이것은 휴식 부위의 식별을 위한 방법의 가용성과 해당 서열에서 DSB에 모집된 인자의 특성화를 반영합니다. 그러나 DSB는 직접 파손을 일으키지 않고 특정 서열 부위에서 반응하지 않는 화합물에 의해 형성된 DNA 부가물을 처리하는 동안 중간체로도 나타납니다. 결과적으로, 이들 제제의 대부분에 대해, 반응 인자 및 복구 단백질과의 결합 상호작용을 분석할 수 있는 기술은 알려져 있지 않다. 예를 들어, DNA 가닥 간 가교 (ICL)는 복제 포크 발생 후 중단을 유발할 수 있습니다. 암 화학 요법제로 널리 사용되는 약물에 의해 형성되었지만 복제 단백질과의 상호 작용을 모니터링하는 방법론은 없었습니다.
여기에서는 이러한 까다로운 부가물과의 포크 충돌에 대한 세포 반응을 따르기 위한 전략을 설명합니다. 우리는 스테로이드 항원을 살아있는 세포의 핵에서 광활성화 의존성 ICL을 형성하는 소랄렌에 연결했습니다. ICL은 항원 태그에 대한 면역형광으로 시각화되었습니다. 태그는 또한 두 항원의 밀접한 연관성을 보고하는 근접 결찰 분석(PLA)의 파트너가 될 수 있습니다. PLA는 태그가 부착된 ICL과 밀접하게 관련된 단백질과 그렇지 않은 단백질을 구별하기 위해 이용되었습니다. ICL과의 만남 후에 유지된 반응성 단백질을 정의하고 손실된 다른 단백질을 식별하는 것이 가능했습니다. 이 접근법은 면역학적으로 검출될 수 있는 모든 구조 또는 DNA 부가물에 적용할 수 있습니다.
Introduction
이중 가닥 절단에 대한 세포 반응은 특정 게놈 부위 1,2,3으로 절단을 지시하는 점점 더 강력한 방법의 연속으로 인해 잘 문서화되어 있습니다. 위치의 확실성은 부위에 축적되고 DNA 손상 반응(DDR)에 참여하는 단백질 및 기타 요인의 명확한 특성 분석을 가능하게 하여 파손을 복구하는 NHEJ(Non-Homologous End Conjoining) 및 HR(Homologous Recombination) 경로를 유도합니다. 물론, 방사선 및 특정 서열을 공격하지 않는 화학종과 같은 작용제에 의해 많은 단절이 발생한다4. 그러나, 이들을 위해, 태깅 및 현지화 5,6에 적합한 구조로 끝을 변환할 수 있는 절차가 있다. 면역글로불린 재배열(immunoglobulin rearrangement)과 같은 생물학적 과정에 의해서도 단절이 발생하며, 최근의 기술은 면역글로불린의 국소화를 허용하고 있다7. 그런 다음 응답 요인과 해당 사이트 간의 관계를 결정할 수 있습니다.
절단은 또한 고유한 차단기가 아니지만 전사 및 복제와 같은 DNA 거래를 방해하는 화합물에 의해 형성된 부가물의 간접적인 결과로 나타납니다. 그들은 아마도 수리 중에 또는 뉴클레아제 공격에 취약한 구조를 유발하기 때문에 이러한 장애물에 대한 세포 반응의 특징으로 형성될 수 있습니다. 전형적으로, 부가물, 단절 및 반응 인자와의 연관성 사이의 물리적 관계는 추론적이다. 예를 들어, ICL은 시스플라틴(cisplatin)과 미토마이신 C(Mitomycin)8와 같은 화학요법제(chemamotherapeutics)에 의해 형성되며, 비염기성 부위(abasic site)9의 반응 생성물로서 형성된다. ICL은 복제 포크(10)에 대한 강력한 블록으로 잘 알려져 있으며, 이에 따라 뉴클레아제(11)에 의해 절단될 수 있는 포크를 지연시킨다. 가닥들 사이의 공유 결합은 종종 중간체(intermediates)12,13로서 절제된 단절을 갖는 경로에 의해 완화되며, 복제 포크(replication fork)를 재구축하기 위해 상동성 재조합을 필요로 한다(14). 대부분의 실험에서 조사자는 복제 포크와 ICL의 충돌 하류에서 형성되는 파손에 대한 관심 요인의 반응을 따릅니다. 그러나 도발적인 병변의 국소화에 대한 기술이 없었기 때문에 ICL에 대한 반응체 및 그 구성 요소의 근접성을 가정 할 수 있습니다.
우리는 ICL에 의해 여기에 설명된 비서열 특이적 공유 부가물과의 단백질 연관성을 분석할 수 있는 전략을 개발했습니다. 우리 시스템에서는 피부 질환 치료제로 수천 년 동안 사용 된 광활성 천연 제품인 psoralen에 의해 도입되었습니다15. 우리의 접근 방식은 psoralens의 두 가지 중요한 기능을 기반으로합니다. 첫 번째는 시스플라틴 또는 미토마이신 C 8,16과 같은 인기 있는 화합물에 의해 형성된 10% 미만과 달리 부가물의 90%를 초과할 수 있는 높은 가교 형성 빈도입니다. 두 번째는 가교 능력의 손실 없이 접합에 대한 화합물의 접근성입니다. 우리는 트리메틸 소랄렌을 오랫동안 확립된 면역태그인 디곡시제닌(Dig)에 공유 결합시켰습니다. 이를 통해 Dig 태그의 면역염색을 통해 게놈 DNA에서 소랄렌 부가물을 검출하고 기존 면역형광법으로 시각화할 수 있습니다17.
이 시약은 이전 연구에서 DNA 섬유 기반 분석16을 사용하여 ICL과의 복제 포크 만남 분석에 적용되었습니다. 그 작업에서 우리는 복제가 온전한 ICL을 지나 계속될 수 있음을 발견했습니다. 이는 ATR 키나아제에 의존적이었고, 이는 복제 스트레스에 의해 활성화된다. 복제 다시 시작은 CMG 복제 헬리케이스의 구조를 고려할 때 예기치 않은 것입니다. 이것은 GINS 복합체(G, PSF1, 2, 3 및 SLD5로 구성됨) 및 CDC45(C)18의 단백질에 의해 고정되는 선도적 가닥 합성을 위한 주형 가닥 주위에 오프셋 갭 고리를 형성하는 MCM 헤테로헥사머(M)로 구성됩니다. 복제가 ICL의 원위 쪽에서 리플리솜 충돌의 쪽에서 다시 시작될 수 있다는 제안은 리플리솜의 구조 변경을 주장했습니다. ICL과의 만남 당시 응답에 어떤 구성 요소가 있었는지에 대한 질문을 해결하기 위해 우리는 여기에 설명된 접근 방식을 개발했습니다. 우리는 Proximity Ligation Assays(PLA)19 의 파트너로서 Dig 태그를 활용하여 ICL과 반응20의 단백질의 밀접한 연관성을 조사했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PLA는 매우 강력한 기술이지만 명확하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 해결해야 하는 기술적 문제가 있습니다. 항체는 높은 친화력과 특이성을 가져야 합니다. 또한 비특이적 배경 신호를 최대한 줄이는 것이 중요합니다. 우리는 막과 세포 파편이 배경에 기여한다는 것을 발견했으며 가능한 한 많이 제거했습니다. 고정하기 전에 완충액을 함유한 세제로 세척하고, 고정한 후 메탄올로 세척하면 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 국립 노화 연구소 (National Institute on Aging, United States)의 NIH 교내 연구 프로그램 (Z01-AG000746-08)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. J.H.는 중국 국립 자연 과학 재단 (21708007 및 31871365)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
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