Visualizzazione di incontri replisali con una lesione bloccante con tag antigene
Summary
Mentre le collisioni della forcella di replicazione con gli addotti del DNA possono indurre rotture a doppio filamento, meno si sa sull’interazione tra replisomi e lesioni bloccanti. Abbiamo impiegato il saggio di legatura di prossimità per visualizzare questi incontri e per caratterizzare le conseguenze per la composizione delle risposte.
Abstract
Sono presenti informazioni considerevoli sulla risposta cellulare alle rotture a doppio filamento (DSB), indotte da nucleasi, radiazioni e altri rompitori di DNA. In parte, ciò riflette la disponibilità di metodi per l’identificazione dei siti di rottura e la caratterizzazione dei fattori reclutati per i DSB in tali sequenze. Tuttavia, i DSB appaiono anche come intermedi durante l’elaborazione di addotti del DNA formati da composti che non causano direttamente rotture e non reagiscono in siti di sequenza specifici. Di conseguenza, per la maggior parte di questi agenti, le tecnologie che consentono l’analisi delle interazioni di legame con i fattori di risposta e le proteine di riparazione sono sconosciute. Ad esempio, i legami incrociati tra filamenti di DNA (ICL) possono provocare rotture in seguito a incontri di fork di replicazione. Sebbene formata da farmaci ampiamente usati come chemioterapici del cancro, non esiste una metodologia per monitorare le loro interazioni con le proteine di replicazione.
Qui, descriviamo la nostra strategia per seguire la risposta cellulare alle collisioni della forcella con questi addotti impegnativi. Abbiamo collegato un antigene steroideo allo psoralene, che forma ICL dipendenti dalla fotoattivazione nei nuclei delle cellule viventi. Le ICL sono state visualizzate mediante immunofluorescenza contro il tag dell’antigene. Il tag può anche essere un partner nel Proximity Ligation Assay (PLA) che riporta la stretta associazione di due antigeni. Il PLA è stato sfruttato per distinguere le proteine che erano strettamente associate alle ICL marcate da quelle che non lo erano. È stato possibile definire le proteine replisome che sono state trattenute dopo incontri con ICL e identificare altre che sono state perse. Questo approccio è applicabile a qualsiasi struttura o addotto del DNA che può essere rilevato immunologicamente.
Introduction
La risposta cellulare alle rotture del doppio filamento è ben documentata a causa di una successione di metodi sempre più potenti per dirigere le rotture verso siti genomici specifici 1,2,3. La certezza della posizione consente una caratterizzazione univoca delle proteine e di altri fattori che si accumulano nel sito e partecipano alla risposta al danno del DNA (DDR), guidando così i percorsi di giunzione finale non omologa (NHEJ) e ricombinazione omologa (HR) che riparano le rotture. Naturalmente, molte rotture sono introdotte da agenti come radiazioni e specie chimiche che non attaccano sequenze specifiche4. Tuttavia, per questi sono disponibili procedure che possono convertire le estremità in strutture suscettibili di tagging e localizzazione 5,6. Le rotture sono introdotte anche da processi biologici, come il riarrangiamento delle immunoglobuline, e la tecnologia recente consente la loro localizzazione, così come7. La relazione tra i fattori di risposta e tali siti può quindi essere determinata.
Le rotture appaiono anche come conseguenza indiretta di addotti formati da composti che non sono interruttori intrinseci ma interrompono le transazioni del DNA come la trascrizione e la replicazione. Possono formarsi come caratteristica della risposta cellulare a queste ostruzioni, forse durante la riparazione o perché provocano una struttura vulnerabile all’attacco della nucleasi. Tipicamente, la relazione fisica tra l’addotto, la rottura e l’associazione con i fattori di risposta è inferenziale. Ad esempio, le ICL sono formate da chemioterapici come il cisplatino e la mitomicina C8 e come prodotto di reazione dei siti abasici9. Le ICL sono ben note come potenti blocchi delle forcelle di replicazione10, bloccando così le forcelle che possono essere scisse dalle nucleasi11. Il legame covalente tra i filamenti è spesso alleviato da vie che hanno rotture obbligate come intermedi12,13, che richiedono una ricombinazione omologa per ricostruire la forcella di replicazione14. Nella maggior parte degli esperimenti il ricercatore segue la risposta dei fattori di interesse alle rotture che si formano a valle della collisione di una forcella di replicazione con una ICL. Tuttavia, poiché non esiste una tecnologia per la localizzazione di una lesione provocatoria, la vicinanza del rispondente e delle sue parti componenti alla ICL può essere solo assunta.
Abbiamo sviluppato una strategia per consentire l’analisi delle associazioni proteiche con addotti covalenti non specifici di sequenza, illustrati qui dalle ICL. Nel nostro sistema questi sono introdotti dallo psoralene, un prodotto naturale fotoattivo utilizzato da migliaia di anni come terapeutico per i disturbi della pelle15. Il nostro approccio si basa su due importanti caratteristiche degli psoraleni. Il primo è la loro alta frequenza di formazione di reticoli, che può superare il 90% degli addotti, in contrasto con il meno del 10% formato da composti popolari come il cisplatino o la mitomicina C 8,16. Il secondo è l’accessibilità del composto alla coniugazione senza perdita di capacità di reticolazione. Abbiamo collegato covalentemente il trimetil psoralene alla digoxigenina (Dig), un immunotag di lunga data. Ciò consente la rilevazione degli addotti psoraleni nel DNA genomico mediante immunocolorazione del tag Dig e visualizzazione mediante immunofluorescenza convenzionale17.
Questo reagente è stato applicato, nel nostro lavoro precedente, all’analisi degli incontri della forcella di replicazione con ICL utilizzando un saggio basato su fibre di DNA16. In quel lavoro abbiamo scoperto che la replica poteva continuare oltre una ICL intatta. Questo dipendeva dalla chinasi ATR, che è attivata dallo stress di replicazione. Il riavvio della replica era inaspettato data la struttura dell’elicasi replicativa CMG. Questo consiste nell’etero-esamero MCM (M) che forma un anello gapped sfalsato attorno al filamento modello per la sintesi del filamento principale che è bloccato dalle proteine del complesso GINS (G, costituito da PSF1, 2, 3 e SLD5) e CDC45 (C) 18. La proposta che la replica potesse ricominciare sul lato del distale ICL sul lato della collisione del risposo sosteneva un cambiamento nella struttura del rispososo. Per rispondere alla questione di quali componenti fossero presenti nella risposta al momento dell’incontro con una Lci, abbiamo sviluppato l’approccio qui descritto. Abbiamo sfruttato il tag Dig come partner in Proximity Ligation Assays (PLA)19 per interrogare la stretta associazione della ICL con le proteine del replisome20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene il PLA sia una tecnica molto potente, ci sono problemi tecnici che devono essere risolti per ottenere risultati chiari e riproducibili. Gli anticorpi devono essere di elevata affinità e specificità. Inoltre, è importante ridurre il più possibile i segnali di fondo non specifici. Abbiamo scoperto che le membrane e i detriti cellulari contribuiscono allo sfondo e li abbiamo rimossi il più possibile. I lavaggi con detergente contenente tamponi prima del fissaggio e il lavaggio con metanolo dopo il fissaggio aiu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata, in parte, dall’Intramural Research Program del NIH, National Institute on Aging, Stati Uniti (Z01-AG000746-08). J.H. è supportato dalla National Natural Science Foundations of China (21708007 e 31871365).
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
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