हम फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग करके माउस एपिडिडिमल फैट पैड से अत्यधिक व्यवहार्य आदिपोज प्रोजेनिटर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल तरीका पेश करते हैं।
मोटापा और मेटाबोलिक विकार जैसे मधुमेह, हृदय रोग और कैंसर, सभी नाटकीय एडीपोज ऊतक रिमॉडलिंग से जुड़े हुए हैं। ऊतक-निवासी एडिपोज प्रोजेनिटर कोशिकाएं (एपीसीएस) ऊतक होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं और ऊतक विकृति में योगदान दे सकती हैं। एकल सेल विश्लेषण प्रौद्योगिकियों का बढ़ता उपयोग-एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण और एकल-कोशिका प्रोटेओमिक्स सहित-जनसंख्या या ऊतक-व्यापी परिवर्तनों के संदर्भ में व्यक्तिगत सेल अभिव्यक्ति परिवर्तनों के अभूतपूर्व संकल्प की अनुमति देकर स्टेम/जनकक्षक क्षेत्र को बदल रहा है । इस लेख में, हम माउस एपिडिडिमल एडीपोज ऊतक को विच्छेदन करने, एकल एडीपोज ऊतक-व्युत्पन्न कोशिकाओं को अलग करने, और व्यवहार्य Sca1+ /CD31-/CD45-/Ter119-APCsके लिए समृद्ध करने के लिए फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) प्रदर्शन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । ये प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को एकल सेल आरएनए अनुक्रमण जैसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाले एपीसीएस तैयार करने की अनुमति देंगे ।
आदिपोस ऊतक ऊर्जा चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अतिरिक्त ऊर्जा लिपिड के रूप में संग्रहीत की जाती है, और एडीपोज ऊतक पोषण की स्थिति और ऊर्जावान मांग के आधार पर महत्वपूर्ण विस्तार या पीछे हटने में सक्षम है। एडिपोसिट ऊतक के विस्तार के परिणामस्वरूप एडिपोसाइट आकार (हाइपरट्रॉफी) और/या आदिपोसाइट संख्या (हाइपरप्लासिया) में वृद्धि से हो सकता है; बाद की प्रक्रिया कसकर प्रसार और एडिपोज प्रोग्निटर कोशिकाओं के भेदभाव से विनियमित1,2. मोटापे के दौरान, ऊतक अत्यधिक फैलता है, और ऊतक रोग – हाइपोक्सिया, सूजन और इंसुलिन प्रतिरोध सहित – अक्सर3,4विकसित होता है। ये जटिलताएं उच्च रक्तचाप, मधुमेह, हृदय रोग, स्ट्रोक और कैंसरसहितकई पुरानी बीमारियों के लिए जोखिम कारक हैं। इसलिए, अनियंत्रित एडीपोज ऊतक विस्तार को सीमित करना और एडीपोज ऊतक विकृतियों को कम करना शीर्ष जैव चिकित्सा अनुसंधान प्राथमिकताएं हैं। आदिपोज ऊतक विस्तार के दौरान, निवासी एडीपोज ऊतक-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाएं (एएससी) क्रमिक रूप से प्रीडिपोसाइट्स (प्रतिबद्ध जनक कोशिकाओं) में और फिर परिपक्व एडिपोसाइट्स6में अंतर करते हैं। हाल ही में एकल कोशिका आरएनए-अनुक्रमण (स्क्रर्ना-एसईक्यू) अध्ययनों से पता चलता है कि ये आदिपोज जनक प्रकोष्ठ (एपीसी) आबादी (एएससी और प्रीडिपोसाइट्स) पर्याप्त आणविकऔर कार्यात्मक विषमता7,8,9,10, 11,12प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, एएससी एक कम एडिपोजेनिक भेदभाव क्षमता प्रदर्शित करता है, जबकि प्रीडिपोसाइट्स7की तुलना में उच्च प्रसार और विस्तार क्षमताओं का प्रदर्शन भी करता है। एएससी और प्रीडिपोसाइट आबादी के भीतर और अधिक आणविक मतभेदों की सूचना दी जाती है, हालांकि इन मतभेदों की कार्यात्मक प्रासंगिकता अस्पष्ट7बनी हुई है। साथ में, ये डेटा आदिपोज जनक सेल पूल की जटिलता को उजागर करते हैं और इन महत्वपूर्ण सेल आबादी को बेहतर ढंग से समझने और हेरफेर करने के लिए उपकरणों को विकसित और मानकीकृत करने की आवश्यकता को रेखांकित करते हैं।
यह प्रोटोकॉल माउस एपिडिडिमल फैट पैड से उच्च व्यवहार्यता Sca1+ एडिपोज प्रोजेनिटर सेल आबादी के अलगाव का विवरण देता है जो संवेदनशील डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त हैं, जिसमें एकल-सेल अध्ययन (स्क्रएनए-अनुक्रमण) और सेल संस्कृति शामिल हैं। अलग-थलग और एपीसी की व्यवहार्यता में सुधार करने वाले मामूली संशोधनों के साथ7,13 वर्णित के रूप में एपीडिडिमल फैट पैड का अलगाव और वियोजन किया गया था। संक्षेप में, एपिडिडिमल फैट पैड से अलग कोशिकाओं को Sca1 के खिलाफ एंटीबॉडी से सना हुआ है, जो एएससी और प्रीडिपोसाइट्स6,7और अन्य वंश (लिन) मार्कर दोनों के लिए एक मार्कर है: Ter119 (एरिथ्रॉइड कोशिकाएं), सीडी 31 (एंडोथेलियल सेल), और सीडी 45 (ल्यूकोसाइट्स)। व्यवहार्य Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI-कोशिकाओं तो फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) द्वारा हल कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल को सफल अलगाव और व्यवहार्य Sca1+/Lin-adipose जनक कोशिकाओं के विश्लेषण द्वारा मान्य किया गया था हाल ही में एक एकल सेल आरएनए अनुक्रमण अध्ययन में रिपोर्ट किया गया था जो एएससी और प्रीडिपोसाइट्स7के भीतर कार्यात्मक रूप से विषम उपजनसंख्या की पहचान करता है ।
एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (स्क्रर्ना-एसईक्यू) एक साथ एकल सेल स्तर पर विविध कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में तेजी से कर्षण प्राप्त कर रहा है। नमूना तैयार करने और उच्च थ्रूपुट…
The authors have nothing to disclose.
हम FACS छंटाई के साथ सहायता के लिए मेयो क्लिनिक माइक्रोस्कोपी सेल विश्लेषण कोर फ्लो साइटोमेट्री सुविधा स्वीकार करते हैं।
1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |