Summary

माउस एपिडिडिमल एडिपोस ऊतकों से आदिपोज प्रोजेनिटर कोशिकाओं की तैयारी

Published: August 25, 2020
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Summary

हम फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग करके माउस एपिडिडिमल फैट पैड से अत्यधिक व्यवहार्य आदिपोज प्रोजेनिटर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल तरीका पेश करते हैं।

Abstract

मोटापा और मेटाबोलिक विकार जैसे मधुमेह, हृदय रोग और कैंसर, सभी नाटकीय एडीपोज ऊतक रिमॉडलिंग से जुड़े हुए हैं। ऊतक-निवासी एडिपोज प्रोजेनिटर कोशिकाएं (एपीसीएस) ऊतक होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं और ऊतक विकृति में योगदान दे सकती हैं। एकल सेल विश्लेषण प्रौद्योगिकियों का बढ़ता उपयोग-एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण और एकल-कोशिका प्रोटेओमिक्स सहित-जनसंख्या या ऊतक-व्यापी परिवर्तनों के संदर्भ में व्यक्तिगत सेल अभिव्यक्ति परिवर्तनों के अभूतपूर्व संकल्प की अनुमति देकर स्टेम/जनकक्षक क्षेत्र को बदल रहा है । इस लेख में, हम माउस एपिडिडिमल एडीपोज ऊतक को विच्छेदन करने, एकल एडीपोज ऊतक-व्युत्पन्न कोशिकाओं को अलग करने, और व्यवहार्य Sca1+ /CD31-/CD45-/Ter119-APCsके लिए समृद्ध करने के लिए फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) प्रदर्शन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । ये प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को एकल सेल आरएनए अनुक्रमण जैसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाले एपीसीएस तैयार करने की अनुमति देंगे ।

Introduction

आदिपोस ऊतक ऊर्जा चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अतिरिक्त ऊर्जा लिपिड के रूप में संग्रहीत की जाती है, और एडीपोज ऊतक पोषण की स्थिति और ऊर्जावान मांग के आधार पर महत्वपूर्ण विस्तार या पीछे हटने में सक्षम है। एडिपोसिट ऊतक के विस्तार के परिणामस्वरूप एडिपोसाइट आकार (हाइपरट्रॉफी) और/या आदिपोसाइट संख्या (हाइपरप्लासिया) में वृद्धि से हो सकता है; बाद की प्रक्रिया कसकर प्रसार और एडिपोज प्रोग्निटर कोशिकाओं के भेदभाव से विनियमित1,2. मोटापे के दौरान, ऊतक अत्यधिक फैलता है, और ऊतक रोग – हाइपोक्सिया, सूजन और इंसुलिन प्रतिरोध सहित – अक्सर3,4विकसित होता है। ये जटिलताएं उच्च रक्तचाप, मधुमेह, हृदय रोग, स्ट्रोक और कैंसरसहितकई पुरानी बीमारियों के लिए जोखिम कारक हैं। इसलिए, अनियंत्रित एडीपोज ऊतक विस्तार को सीमित करना और एडीपोज ऊतक विकृतियों को कम करना शीर्ष जैव चिकित्सा अनुसंधान प्राथमिकताएं हैं। आदिपोज ऊतक विस्तार के दौरान, निवासी एडीपोज ऊतक-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाएं (एएससी) क्रमिक रूप से प्रीडिपोसाइट्स (प्रतिबद्ध जनक कोशिकाओं) में और फिर परिपक्व एडिपोसाइट्स6में अंतर करते हैं। हाल ही में एकल कोशिका आरएनए-अनुक्रमण (स्क्रर्ना-एसईक्यू) अध्ययनों से पता चलता है कि ये आदिपोज जनक प्रकोष्ठ (एपीसी) आबादी (एएससी और प्रीडिपोसाइट्स) पर्याप्त आणविकऔर कार्यात्मक विषमता7,8,9,10, 11,12प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, एएससी एक कम एडिपोजेनिक भेदभाव क्षमता प्रदर्शित करता है, जबकि प्रीडिपोसाइट्स7की तुलना में उच्च प्रसार और विस्तार क्षमताओं का प्रदर्शन भी करता है। एएससी और प्रीडिपोसाइट आबादी के भीतर और अधिक आणविक मतभेदों की सूचना दी जाती है, हालांकि इन मतभेदों की कार्यात्मक प्रासंगिकता अस्पष्ट7बनी हुई है। साथ में, ये डेटा आदिपोज जनक सेल पूल की जटिलता को उजागर करते हैं और इन महत्वपूर्ण सेल आबादी को बेहतर ढंग से समझने और हेरफेर करने के लिए उपकरणों को विकसित और मानकीकृत करने की आवश्यकता को रेखांकित करते हैं।

यह प्रोटोकॉल माउस एपिडिडिमल फैट पैड से उच्च व्यवहार्यता Sca1+ एडिपोज प्रोजेनिटर सेल आबादी के अलगाव का विवरण देता है जो संवेदनशील डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त हैं, जिसमें एकल-सेल अध्ययन (स्क्रएनए-अनुक्रमण) और सेल संस्कृति शामिल हैं। अलग-थलग और एपीसी की व्यवहार्यता में सुधार करने वाले मामूली संशोधनों के साथ7,13 वर्णित के रूप में एपीडिडिमल फैट पैड का अलगाव और वियोजन किया गया था। संक्षेप में, एपिडिडिमल फैट पैड से अलग कोशिकाओं को Sca1 के खिलाफ एंटीबॉडी से सना हुआ है, जो एएससी और प्रीडिपोसाइट्स6,7और अन्य वंश (लिन) मार्कर दोनों के लिए एक मार्कर है: Ter119 (एरिथ्रॉइड कोशिकाएं), सीडी 31 (एंडोथेलियल सेल), और सीडी 45 (ल्यूकोसाइट्स)। व्यवहार्य Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI-कोशिकाओं तो फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) द्वारा हल कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल को सफल अलगाव और व्यवहार्य Sca1+/Lin-adipose जनक कोशिकाओं के विश्लेषण द्वारा मान्य किया गया था हाल ही में एक एकल सेल आरएनए अनुक्रमण अध्ययन में रिपोर्ट किया गया था जो एएससी और प्रीडिपोसाइट्स7के भीतर कार्यात्मक रूप से विषम उपजनसंख्या की पहचान करता है ।

Protocol

मेयो क्लिनिक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदन के तहत सभी पशु प्रायोगिक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया । 1. समाधान की तैयारी 100 एमएल हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (…

Representative Results

इस प्रयोग में चार महीने के पुरुष एफबी चूहों का इस्तेमाल किया गया। एफएससी/एसएससी भूखंडों का उपयोग करके मलबे और डबल्स के बहिष्कार के बाद, व्यवहार्य कोशिकाओं (DAPI-जनसंख्या) को गेट किया गया था, जिसके बाद एपीस?…

Discussion

एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (स्क्रर्ना-एसईक्यू) एक साथ एकल सेल स्तर पर विविध कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में तेजी से कर्षण प्राप्त कर रहा है। नमूना तैयार करने और उच्च थ्रूपुट…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम FACS छंटाई के साथ सहायता के लिए मेयो क्लिनिक माइक्रोस्कोपी सेल विश्लेषण कोर फ्लो साइटोमेट्री सुविधा स्वीकार करते हैं।

Materials

1.7 mL microcentrifuge tube VWR 87003-294
13 mL culture tube Thermo Fisher Scientific 50-809-216
15 mL conical tube Greiner Bio-one 188 271
5 mL test tube with cell strainer snap cap Thermo Fisher Scientific 08-771-23
50 mL conical tube Greiner Bio-one 227 261
70 µm cell strainer Thermo Fisher Scientific 22-363-548
Anti-CD31-FITC antibody Miltenyi Biotec 130-102-519
Anti-CD45-FITC antibody Miltenyi Biotec 130-102-491
Anti-Sca1-APC antibody Miltenyi Biotec 130-102-833
Anti-Ter119-FITC antibody Miltenyi Biotec 130-112-908
BSA Gold Biotechnology A-420-500
Collagenase type II Thermo Fisher Scientific 17101-015
DAPI Thermo Fisher D1306
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-144
F-12 medium Thermo Fisher Scientific 11765-054
FcR blocking reagent Miltenyi Biotec 130-092-575
Hanks' balanced salt solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14025-092
Horse serum Thermo Fisher Scientific 16050-122
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Propidium iodide solution Miltenyi Biotec 130-093-233

References

  1. Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
  2. Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
  4. Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
  5. Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
  6. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
  7. Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
  8. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
  9. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
  10. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
  11. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
  12. Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
  13. De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
  14. Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
  15. Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
  16. Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
  17. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  18. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).

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Citer Cet Article
Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (162), e61694, doi:10.3791/61694 (2020).

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