Fremstilling av fett stamceller fra mus epididymal fettvev
Summary
Vi presenterer en enkel metode for å isolere svært levedyktige fett stamceller fra mus epididymal fett pads ved hjelp av fluorescens aktivert celle sortering.
Abstract
Fedme og metabolske forstyrrelser som diabetes, hjertesykdom og kreft, er alle forbundet med dramatisk fettvev remodeling. Vev-resident fett stamceller (APCer) spille en nøkkelrolle i fettvev homeostase og kan bidra til vev patologi. Den økende bruken av encellede analyseteknologier – inkludert encellede RNA-sekvensering og encellede proteomikk – forvandler stamcellefeltet ved å tillate enestående oppløsning av individuelle celleuttrykksendringer i sammenheng med endringer i hele befolkningen eller vev. I denne artikkelen gir vi detaljerte protokoller for å dissekere mus epididymal fettvev, isolere enkelt fettvev-avledede celler, og utføre fluorescens aktivert celle sortering (FACS) for å berike for levedyktig Sca1+/ CD31–/ CD45–/ Ter119– APCer. Disse protokollene vil tillate etterforskere å forberede høy kvalitet APCer egnet for nedstrøms analyser som enkeltcellede RNA sekvensering.
Introduction
Fettvev spiller en nøkkelrolle i energimetabolismen. Overflødig energi lagres i form av lipider, og fettvev er i stand til betydelig ekspansjon eller tilbaketrekking avhengig av ernæringsstatus og energisk etterspørsel. Utvidelse av fettvev kan skyldes en økning i adipocyttstørrelse (hypertrofi) og/eller fra en økning i adipocyttnummer (hyperplasi); den sistnevnte prosessen tett regulert av spredning og differensiering av fett stamceller1,2. Under fedme, fettvev utvider seg overdrevet, og vev dysfunksjon – inkludert hypoksi, betennelse, og insulinresistens – utvikler ofte3,4. Disse komplikasjonene er risikofaktorer for mange kroniske sykdommer, inkludert hypertensjon, diabetes, kardiovaskulære sykdommer, hjerneslag og kreft5. Derfor er det å begrense ukontrollert fettvevsutvidelse og redusere fettvevspatologier topp biomedisinske forskningsprioriteringer. Under fettvevsutvidelse sprer resident fettvevsavledede stamceller (ASCer) seg og differensierer sekvensielt til preadipocytter (engasjerte stamceller) og deretter til modne adipocytter6. Nyere encellede RNA-sekvenseringsstudier (scRNA-seq) viser at disse fettstamtamcellepopulasjonene (APC) (ASC og preadipocytter) viser betydelig molekylær og funksjonell heterogenitet7,8,9,10,11,12. AsCs viser for eksempel en redusert adipogenic differensieringskapasitet, samtidig som den viser høyere sprednings- og ekspansjonsfunksjoner, sammenlignet med preadipocytter7. Ytterligere molekylære forskjeller rapporteres innenfor ASC- og preadipocyttpopulasjoner, selv om den funksjonelle relevansen av disse forskjellene fortsatt er uklar7. Sammen fremhever disse dataene kompleksiteten i fettstamcelleutvalget og understreker behovet for å utvikle og standardisere verktøy for å bedre forstå og manipulere disse kritiske cellepopulasjonene.
Denne protokollen beskriver isoleringen av høy levedyktighet Sca1+ fett stamcellepopulasjoner fra mus epididymal fett pads som er egnet for sensitive nedstrøms analyser, inkludert encellede studier (scRNA-sekvensering) og cellekultur. Isolasjon og dissosiasjon av epididymale fettputer ble utført som tidligere beskrevet7,13 med små modifikasjoner som forbedrer levedyktigheten til isolerte APCer. Kort sagt er dissosierte celler fra epididymale fettputer farget med antistoffer mot Sca1, en markør for både ASC og preadipocytter6,7og andre lineage (Lin) markører: Ter119 (erythroid celler), CD31 (endotelceller) og CD45 (leukocytter). Levedyktig Sca1+/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– celler sorteres deretter etter fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Viktigere, denne protokollen ble validert ved vellykket isolasjon og analyse av levedyktig Sca1+/ Lin– fett stamceller rapportert i en nylig enkeltcellede RNA sekvensering studie som identifiserte funksjonelt heterogene underpopulasjoner innenfor ASCs og preadipocytes7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enkeltcellede RNA-sekvensering (scRNA-seq) får raskt trekkraft som et kraftig verktøy for samtidig å studere ulike cellepopulasjoner på enkeltcellenivå. På grunn av høye kostnader forbundet med prøveforberedelse og høy gjennomstrømningssekvensering, er det viktig å optimalisere cellulære innganger (høy levedyktighet og renhet) for å øke sannsynligheten for eksperimentell suksess. Noen celleforberedelsesprotokoller er avhengige av fjerning av døde celler og rusk ved hjelp av lavspinnvasker og kolonnebasert…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility for hjelp med FACS sortering.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
