التصوير الحي المتزامن للأجنة الحشرية المتعددة في مجاهر فلورسينس ورقة الضوء المستندة إلى غرفة العينة
Summary
المجهر الفلوري القائم على الورقة الخفيفة هو الأداة الأكثر قيمة في علم الأحياء التنموي. ومن القضايا الرئيسية في الدراسات المقارنة التباين المحيط. يصف بروتوكولنا إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن لعينات متعددة ، وبالتالي ، يعالج هذه المشكلة بشكل نشط.
Abstract
يوفر المجهر الفلوري القائم على الورق الخفيف حلولا فعالة لدراسة العمليات المعقدة على نطاقات متعددة ذات صلة بيولوجيا. نماذج الأجهزة القائمة على غرفة، والتي تم تصميمها خصيصا للحفاظ على سلامة ثلاثية الأبعاد للعينة وعادة ما ميزة دوران العينة، هي الخيار الأفضل في علم الأحياء التنموية. على سبيل المثال ، تم استخدامها لتوثيق التكوين الجنيني الكامل لذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster وخنفساء الدقيق الأحمر Tribolium castaneum. ومع ذلك، فإن العديد من بروتوكولات التصوير الحي المتاحة توفر أطرا تجريبية فقط للأجنة المفردة. خاصة بالنسبة للدراسات المقارنة ، فإن مثل هذه النهج غير مريحة ، لأن العينات المصورة بالتتابع تتأثر بالتباين المحيط. علاوة على ذلك ، يحد هذا من عدد العينات التي يمكن فحصها في غضون وقت معين. نحن نقدم إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن الذي يزيد من الإنتاجية في الأجهزة القائمة على غرفة العينة وبالتالي يضمن ظروفا محيطة مماثلة لجميع العينات. أولا، نحن نقدم إرشادات المعايرة للمجاهر الفلورية ذات الورقة الخفيفة. ثانيا، نقترح طريقة تركيب للأجنة المتعددة التي تتوافق مع دوران العينة. ثالثا، نحن نقدم نموذجية ثلاثية الأبعاد مجموعات بيانات التصوير الحي من Drosophila، والتي نحن الجمع بين ثلاثة خطوط المعدلة وراثيا مع نواة المسمى fluorescently، وكذلك من Tribolium، والتي نقارن أداء ثلاثة خطوط فرعية المعدلة وراثيا التي تحمل نفس الجين، ولكن في مواقع الجينوم المختلفة. تم تصميم بروتوكولنا خصيصا للدراسات المقارنة لأنه يعالج بشكل نشط التباين المحيط ، والذي يكون موجودا دائما في التصوير الحي التسلسلي. وهذا مهم بشكل خاص للتحليلات الكمية وتوصيف الأنماط الظاهرية الشاذة، والتي تنتج على سبيل المثال، عن تجارب خروج المغلوب. علاوة على ذلك ، فإنه يزيد من الإنتاجية الإجمالية ، والتي هي مريحة للغاية عندما يكون الوصول إلى مجاهر مضان الصفائح الخفيفة محدودا. وأخيرا، يمكن تكييف طريقة التركيب المقترحة لأنواع الحشرات الأخرى والكائنات الحية النموذجية الأخرى، مثل سمك الحمار الوحشي، مع عدم بذل أي جهد للتحسين.
Introduction
يعد الفحص المجهري الفلوري أحد أهم تقنيات التصوير في علوم الحياة، وخاصة في بيولوجيا الخلايا والتطور. في المجاهر الفلورية confocal1، والتي هي دولة من بين الفن للتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد منذ منتصف 1990s ، وتستخدم نفس العدسة لإثارة الفلوروفور والكشف عن ضوء الانبعاثات. شعاع ليزر الإضاءة يثير جميع الفلوروفور على طول محور الإضاءة / الكشف ويتم التمييز بين إشارة خارج التركيز المعنية قبل الكشف عن طريق ثقب. وبالتالي ، لكل صورة ثنائية الأبعاد ، يتم إضاءة العينة بأكملها. وبالتالي ، لكل صورة ثلاثية الأبعاد ، أي كومة من الصور ثنائية الأبعاد المتتالية مكانيا ، يتم إضاءة العينة بأكملها عدة عشرات إلى بضع مئات من المرات2، مما يعزز photobleaching والسمية الضوئية3.
منذ ما يقرب من عشرين عاما ، ظهرت التكنولوجيا المستندة إلى ورقة الضوء4 كبديل واعد للتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد ، وبالتالي أصبحت أداة قيمة في علم الأحياء التنموي5. وفي هذا النهج، يتم فصل الإضاءة والكشف. تستخدم عدسة الإضاءة لتوليد ورقة ضوئية بعمق لا يتجاوز بضعة ميكرومترات داخل المستوى البؤري لعدسة الكشف المرتبة عموديا. وبالتالي ، لكل صورة ثنائية الأبعاد ، يتم إضاءة حجم مستو رفيع فقط حول المستوى البؤري. وبالتالي ، لكل صورة ثلاثية الأبعاد ، يتم إضاءة العينة بأكملها مرة واحدة فقط ، مما يقلل بقوة من الbleaching الضوئي والسمية الضوئية6. ولهذا السبب، توفر المجاهر الفلورية ذات الصفائح الخفيفة حلولا فعالة لدراسة العمليات المعقدة على نطاقات متعددة ذات صلة بيولوجيا، وبالتالي فهي ذات قيمة خاصة في البيولوجيا التنموية، حيث يجب تحليل عينات كبيرة مثل عدة ملليمترات على المستوى دون الخلوي.
تاريخيا، وقد LSFMs عينة على أساس غرفة7،8. في هذه الاجهزة، عادة ما يتم ترتيب الإضاءة (س) والكشف (ض) محاور عموديا على محور الجاذبية (ص). غرف العينة توفر حرية تجريبية وافرة. أولا، أنها توفر قدرات التخزين المؤقت التصوير كبيرة، والتي بدورها يخفف من استخدام نظام التشوه للسيطرة على البيئة، على سبيل المثال، للحفاظ على درجة حرارة محددة9 أو لتطبيق الضغوطات الكيميائية الحيوية. علاوة على ذلك ، فإنها تدعم أساليب التركيب المخصصة10 المصممة لتلبية الاحتياجات التجريبية ذات الصلة مع الحفاظ على الأبعاد الثلاثة ، في بعض الحالاتالديناميكية 11، سلامة العينة. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما تكون مجهزة نماذج غرفة القائم على وظيفة دوران التي تستخدم لتدور العينات حول محور ص وبالتالي صورة لهم على طول اثنين، أربعة أو أكثر من الاتجاهات. وبما أن أجنة الكائنات النموذجية الشائعة الاستخدام هي، في سياق المجهر، فإن التصوير الكبير نسبيا والمتعاقب على طول محاور الجسم البطنية الظهرية والجانبية و/أو الأمامية الخلفية يوفر تمثيلا أكثر شمولا. وهذا يسمح على سبيل المثال، تتبع طويل الأجل للخلايا التي تتحرك على طول مسارات الهجرة ثلاثية الأبعاد المعقدة12،13.
وقد تم تطبيق المجهر المضان على أساس ورقة الضوء على نطاق واسع لدراسة التكوين المورفوجيني الجنيني من الميلانوغاستر Drosophila، وكلاهما بشكل منهجي14،15 وكذلك مع التركيز بشكل خاص على الجوانب الفيزيائية الحيوية للتنمية. على سبيل المثال، تم استخدامه لجمع بيانات مورفوجينية عالية الدقة من أجل الكشف عن وجود صلة ميكانيكية حيوية بين إندورفينيشن إندوديرم وتمديد المحور أثناء استطالة الفرقة الجرثومية16 وبالإضافة إلى ذلك لربط التدفق الخلوي المعقد بأنماط توليد القوة أثناء التجويف17. كما تم دمجها مع تقنيات أخرى حديثة ، على سبيل المثال ، optogenetics للتحقيق في تنظيم إشارات WNT أثناء النقش الأمامي الخلفي في البشرة18.
ومع ذلك، فإن دراسة نوع واحد فقط لا يوفر رؤى حول تطور التنمية. لفهم تكوين الأجنة في السياق النباتي ، تم إجراء أبحاث مكثفة مع كائنات نموذج الحشرات البديلة. واحدة من الأنواع الأكثر شمولا التحقيق هو خنفساء الدقيق الأحمر Tribolium كاستانيوم، وهي آفة الحبوب المخزنة ذات الصلة اقتصاديا19، والتي تم أيضا تصويرها بشكل منهجي مع تكوين المورفوجين الجنيني مع LSFM20. يختلف التكوين الجنيني لهذين النوعين بشكل ملحوظ في عدة جوانب ، على سبيل المثال ، وضع التقسيم21، وكذلك تكوين وتدهور الأغشية الجنينية22. وقد تم بالفعل تحليل هذا الجانب الأخير على نطاق واسع باستخدام LSFMs. على سبيل المثال، فقد ثبت أن سيروسا، وهو نسيج خارج الجنين الذي يغلف ويحمي جنين تريبوليوم من المخاطر المختلفة للجزء الأفضل من تكوين الجنين23،24، يعمل أيضا ك “سائق” مورفوجيني لعملية الانسحاب الخاصة به أثناء الإغلاق الظهري25. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أنه خلال gastrulation ، لا تزال منطقة معينة من blastoderm راسية في الغشاء الهوتيلي من أجل إنشاء حركات الأنسجة غير المتماثلة26 ، وبعد هذه الملاحظة ، أن سيولة الأنسجة الإقليمية تسمح للخلايا بمغادرة حافة سيروسا بشكل متسلسل أثناء إغلاق نافذة serosa27.
في جميع Drosophila– والدراسات المرتبطة Triboliumالمذكورة أعلاه، وقد استخدمت عينات LSFMs القائمة على غرفة. في معظم, وسجلت الأجنة على طول اتجاهات متعددة باستخدام وظيفة دوران العينة. على الرغم من أن لم يذكر صراحة, يمكن افتراض أن تم تسجيلها بشكل فردي، وبالتالي مستقلة عن بعضها البعض في مقايسات التصوير الحية متتابعة, مماثلة لعملنا السابق على Tribolium20,28. وفي بعض السيناريوهات، يكون هذا النهج مقبولا، ولكن على وجه الخصوص في النهج المقارنة الكمية، يمكن أن يشوه التباين المحيط النتائج. على سبيل المثال ، كان من المعروف منذ فترة طويلة أن سرعة نمو الحشرات تعتمد على درجة الحرارة29، ولكن دراسة أحدث تشير إلى أنه في Drosophila، قد تؤثر درجة الحرارة أيضا على تركيز المورفوجينات30. وبالتالي، إذا كان ينبغي تحديد خصائص معينة لنشأة الجنين، مثل النسب الدينامية ومعدلات التقسيم وسرعات الهجرة للخلايا، على وجه التحديد، يلزم تكرار كاف دون تباين محيط. وهذا يقلل من الانحرافات المعيارية والأخطاء المعيارية، والتي بدورها تسهل التجاور مع غيرها، حتى مجرد ظروف تجريبية متباينة هامشيا.
ومع ذلك، تم تصميم نموذج LSFMs المستندة إلى غرفة أساسا لمحتوى عالي بدلا من المقايسات الإنتاجية العالية. على عكس المجاهر confocal ، والتي عادة ما تكون مجهزة بآليات المشبك الموحدة لشرائح المجهر ، وأطباق بيتري ولوحات الآبار ، تستخدم جميع أجهزة LSFMs القائمة على غرفة العينة تقريبا آليات المشبك المستندة إلى الأسطوانات. وتهدف هذه الآليات لأصحاب العينة حسب الطلب التي هي التناوب متوافقة وكذلك غير الغازية10، ولكن عادة لا صمم لأكثر من عينة واحدة20،31،32. ويتناول إطار التصوير الحي المتزامن لأجنة أو أكثر، حيث لا تتعرض مزايا الأجهزة القائمة على غرفة العينة للخطر، مسألة التباين المحيط وبالتالي زيادة قيمة LSFMs للدراسات المقارنة.
في بروتوكولنا، نقدم إطارا تجريبيا للتصوير الحي المقارن في عينات LSFMs القائمة على غرفة(الشكل 1A)حيث يتم استخدام محور ص كخيار ل “كومة” الأجنة. أولا، نحن نقدم مبادئ توجيهية للمعايرة الفلورية القائمة على الميكروسفيرات لآليات LSFMs القائمة على غرفة العينة، وهو أمر مهم بشكل خاص للأجهزة التي تفتقر إلى مساعد المعايرة. ثانيا، نحن نصف طريقة تركيب للأجنة متعددة على أساس حامل خيوط العنكبوت28 (الشكل 1B)التي تتوافق مع دوران العينة، وبالتالي يسمح التصوير المتزامن لعينات متعددة على طول اتجاهات متعددة(الشكل 1C). يتم محاذاة العديد من الأجنة فوق فيلم أغاروز رقيقة، وبعد إدراجها في غرفة العينة، انتقلت تباعا من خلال ورقة الضوء للحصول على صور ثلاثية الأبعاد. ثالثا، نحن نقدم ثلاث مجموعات بيانات تصوير حي مثالية ل Drosophila وكذلك لتريبوليوم. بالنسبة للأول ، فإننا نخلط بين الخطوط المعدلة وراثيا مع نواة تحمل علامة fluorescently. وبالنسبة لهذا الأخير، فإننا نقارن أداء الخطوط الفرعية المعدلة وراثيا التي تحمل نفس المتحولين جنسيا، ولكن في مواقع الجينوم المختلفة. وأخيرا، نناقش أهمية التوازي فيما يتعلق بالتصوير الحي المقارن والتباين المحيط33،ونناقش الحد الإنتاجي لإطارنا التجريبي ونقيم تكييف نهجنا مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحدة من مجالات التطبيق الحصري ل LSFMs هو علم الأحياء التنموي. في هذا التخصص ، من المهم النظر إلى العينات الحية ، وإلا لا يمكن وصف العمليات المورفوجينية بطريقة ديناميكية. إطار تجريبي للتصوير الحي المتزامن في عينات LSFMs المستندة إلى غرفة ، كما هو موضح هنا ، مناسب لسببين رئيسيين.
?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر إرنست ه. ك. ستيلزر على الفرصة المتاحة له لاستخدام موارده وكذلك تعليقاته القيمة فيما يتعلق بالمخطوطة، وأنيتا أندرل لدعمها التصوير الحي لتريبونيوم، وسفين بلاث للحصول على الدعم الفني، وكذلك إيلان ديفيس ونيكول غريغدر وجيرولد شوبيغر لتقاسم خطوط دروسوفيلا المعدلة وراثيا عبر مركز بلومينغتون للأسهم.
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
