Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen
Summary
Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.
Abstract
Op lichtplaat gebaseerde fluorescentiemicroscopie biedt efficiënte oplossingen om complexe processen op meerdere biologisch relevante schalen te bestuderen. Op de monsterkamer gebaseerde opstellingen, die specifiek zijn ontworpen om de driedimensionale integriteit van het monster te behouden en meestal voorzien zijn van monsterrotatie, zijn de beste keuze in ontwikkelingsbiologie. Ze zijn bijvoorbeeld gebruikt om de volledige embryonale morfogenese van de fruitvlieg Drosophila melanogaster en de rode meelkever Tribolium castaneum te documenteren. Veel beschikbare live beeldvormingsprotocollen bieden echter alleen experimentele kaders voor enkele embryo’s. Vooral voor vergelijkende studies zijn dergelijke benaderingen lastig, omdat opeenvolgend afgebeelde exemplaren worden beïnvloed door omgevingsafwijkingen. Verder beperkt dit het aantal exemplaren dat binnen een bepaalde tijd kan worden afgeteld. We bieden een experimenteel raamwerk voor gelijktijdige live beeldvorming dat de doorvoer in op de monsterkamer gebaseerde opstellingen verhoogt en zo zorgt voor vergelijkbare omgevingsomstandigheden voor alle monsters. Ten eerste bieden we een kalibratierichtlijn voor lichtplaatfluorescentiemicroscopen. Ten tweede stellen wij een montagemethode voor meerdere embryo’s voor die compatibel is met monsterrotatie. Ten derde bieden we voorbeeldige driedimensionale live imaging datasets van Drosophila, waarvoor we drie transgene lijnen naast elkaar plaatsen met fluorescerend gelabelde kernen, evenals van Tribolium, waarvoor we de prestaties vergelijken van drie transgene sublijnen die hetzelfde transgeen dragen, maar op verschillende genomische locaties. Ons protocol is speciaal ontworpen voor vergelijkende studies omdat het proactief omgevingsafwijkingen aanpakt, die altijd aanwezig zijn in sequentiële live beeldvorming. Dit is vooral belangrijk voor kwantitatieve analyses en karakterisering van aberrationele fenotypes, die bijvoorbeeld het gevolg zijn van knock-out experimenten. Verder verhoogt het de algehele doorvoer, wat zeer handig is wanneer de toegang tot fluorescentiemicroscopen van lichtplaten beperkt is. Ten slotte kan de voorgestelde montagemethode worden aangepast voor andere insectensoorten en andere modelorganismen, bijvoorbeeld zebravissen, zonder optimalisatie-inspanning.
Introduction
Fluorescentiemicroscopie is een van de meest essentiële beeldvormingstechnieken in de biowetenschappen, vooral in de cel- en ontwikkelingsbiologie. In confocale fluorescentiemicroscopen1, die sinds het midden van de jaren negentig state-of-the-art zijn voor driedimensionale fluorescentiebeeldvorming, wordt dezelfde lens gebruikt voor fluorofoor excitatie en emissielichtdetectie. De verlichtingslaserstraal prikkelt alle fluoroforen langs de verlichtings-/detectieas en het betreffende storingssignaal wordt vóór detectie door een pinhole gediscrimineerd. Daarom wordt voor elk tweedimensionaal beeld het hele exemplaar verlicht. Bijgevolg wordt voor elk driedimensionaal beeld, d.w.z. een stapel ruimtelijk opeenvolgende tweedimensionale beelden, het hele exemplaar enkele tientallen tot enkele honderden kerenverlicht 2, wat fotobleaching en fototoxiciteitbevordert 3.
Bijna twintig jaar geleden kwam lichtplaattechnologie4 naar voren als een veelbelovend alternatief voor driedimensionale fluorescentiebeeldvorming en werd zo een waardevol hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie5. In deze benadering worden verlichting en detectie ontkoppeld. De verlichtingslens wordt gebruikt om een lichtplaat te genereren met een diepte van slechts enkele micrometers binnen het brandpuntsvlak van de loodrecht gerangschikte detectielens. Daarom wordt voor elk tweedimensionaal beeld slechts een dun vlak rond het brandpuntsvlak verlicht. Bijgevolg wordt voor elk driedimensionaal beeld het hele exemplaar slechts één keer verlicht, wat fotobleaching en fototoxiciteit sterk vermindert6. Om deze reden bieden lichtplaatfluorescentiemicroscopen (LSFMs) efficiënte oplossingen om complexe processen op meerdere biologisch relevante schalen te bestuderen en zijn daarom van bijzondere waarde in de ontwikkelingsbiologie, waar monsters zo groot als enkele millimeters op subcellulair niveau moeten worden geanalyseerd.
Historisch gezien zijn LSFM ‘s op de steekproefkamer gebaseerd7,8. In deze opstellingen staan de verlichtingsassen (x) en detectieassen (z) meestal loodrecht op de zwaartekrachtas (y). Monsterkamers bieden voldoende experimentele vrijheid. Ten eerste bieden ze grote beeldbuffercapaciteiten, wat op zijn beurt het gebruik van een perfusiesysteem vergemakkelijkt om de omgeving te beheersen, bijvoorbeeld om een specifieke temperatuur9 te handhaven of biochemische stressoren toe te passen. Verder ondersteunen ze aangepaste montagemethoden10 die zijn afgestemd op de respectieve experimentele behoeften met behoud van de driedimensionale, in sommige gevallen dynamische11, integriteit van het monster. Bovendien zijn op de monsterkamer gebaseerde opstellingen meestal uitgerust met een rotatiefunctie die wordt gebruikt om de monsters rond de y-as te draaien en ze zo langs twee, vier of zelfs meer richtingen te weergeven. Aangezien embryo’s van veelgebruikte modelorganismen in de context van microscopie relatief grote, opeenvolgende beeldvorming langs de ventrale dorsale, laterale en/of voorste-posterieure lichaamsassen zijn, biedt een uitgebreidere weergave. Dit maakt bijvoorbeeld het mogelijk om cellen op lange termijn te volgen die zich langs complexe driedimensionale migratiepaden12,13bewegen .
Lichtbladgebaseerde fluorescentiemicroscopie is uitgebreid toegepast om de embryonale morfogenese van Drosophila melanogasterte bestuderen, zowel systematisch14,15 als met een specifieke focus op de biofysische aspecten van ontwikkeling. Het werd bijvoorbeeld gebruikt om morfogenetische gegevens met hoge resolutie te verzamelen om een biomechanisch verband te detecteren tussen endoderm-invaginatie en asuitbreiding tijdens kiembandverlenging16 en verder om de complexe cellulaire stroom te relateren met krachtgeneratiepatronen tijdens gastrulatie17. Het is ook gecombineerd met andere state-of-the-art technieken, bijvoorbeeld optogenetica om de regulatie van Wnt-signalering tijdens voor-posterieure patronen in de epidermis18te onderzoeken .
Het bestuderen van slechts één soort geeft echter geen inzicht in de evolutie van de ontwikkeling. Om embryogenese binnen de fylogenetische context te begrijpen, is intensief onderzoek uitgevoerd met alternatieve insectenmodelorganismen. Een van de meest uitgebreid onderzochte soorten is de rode meelkever Tribolium castaneum, een economisch relevante opgeslagen graanplaag19, waarvan de embryonale morfogenese ook al systematisch is afgebeeld met LSFM20. De embryonale morfogenese van deze twee soorten verschilt opmerkelijk in verschillende aspecten, bijvoorbeeld de segmentatiemodus21, evenals de vorming en afbraak van extra-embryonale membranen22. Dit laatste aspect is al uitgebreid geanalyseerd met behulp van LSFMs. Zo is aangetoond dat de serosa, een extra-embryonaal weefsel dat het Tribolium-embryo omhult en beschermt tegen verschillende gevaren voor het grootste deel van zijn embryogenese23,24, ook fungeert als de morfogenetische “driver” voor zijn eigen terugtrekkingsproces tijdens dorsale sluiting25. Verder is aangetoond dat tijdens gastrulatie een bepaald gebied van het blastoderm verankerd blijft aan het vitellinemembraan om asymmetrische weefselbewegingen te creëren26 en, na deze observatie, dat geregionaliseerde weefselfluïdisatie cellen in staat stelt om de serosarand opeenvolgend te verlaten tijdens serosa-raamsluiting27.
In alle hierboven genoemde drosophila-en tribolium-geassocieerdestudies zijn LSFMs op basis van de steekproefkamer gebruikt. In de meeste gevallen werden de embryo’s in meerdere richtingen geregistreerd met behulp van de monsterrotatiefunctie. Hoewel niet expliciet vermeld, kan worden aangenomen dat ze individueel en dus onafhankelijk van elkaar zijn geregistreerd in opeenvolgende live beeldvormingstesten, vergelijkbaar met ons eerdere werk over Tribolium20,28. In bepaalde scenario’s is een dergelijke benadering aanvaardbaar, maar vooral in kwantitatieve vergelijkende benaderingen kan omgevingsafwijking de resultaten verstoren. Het is bijvoorbeeld al lang bekend dat de ontwikkelingssnelheid van insecten temperatuurafhankelijk is29, maar een recentere studie suggereert verder dat in Drosophilade temperatuur ook de concentratie van morfogenen30kan beïnvloeden . Als bepaalde kenmerken van embryogenese, bijvoorbeeld de dynamische verhoudingen, de delingspercentages en migratiesnelheden van cellen, nauwkeurig moeten worden gekwantificeerd, zijn voldoende herhalingen zonder omgevingsafwijking vereist. Dit minimaliseert standaardafwijkingen en standaardfouten, wat op zijn beurt het naast elkaar plaatsen vergemakkelijkt, zelfs slechts marginaal uiteenlopende experimentele omstandigheden.
LSFMs op basis van de steekproefkamer zijn echter voornamelijk ontworpen voor testtesten met een hoog gehalte in plaats van voor hoge doorvoer. In tegenstelling tot confocale microscopen, die meestal zijn uitgerust met gestandaardiseerde klemmechanismen voor microscopieglaasjes, Petrischalen en putplaten, gebruiken bijna alle op de monsterkamer gebaseerde LSFMs op cilinder gebaseerde klemmechanismen. Deze mechanismen zijn bedoeld voor op maat gemaakte monsterhouders die rotatiecompatibel en niet-invasiefzijn 10, maar meestal niet zijn ontworpen voor meer dan één monster20,31,32. Een kader voor gelijktijdige levende beeldvorming van twee of meer embryo’s, waarbij de voordelen van op de steekproefkamer gebaseerde opstellingen niet in het gedrang komen, pakt het probleem van de omgevingsafwijking aan, waardoor de waarde van LSFM’s voor vergelijkende studies toeneemt.
In ons protocol presenteren we een experimenteel kader voor vergelijkende live beeldvorming in op de steekproefkamer gebaseerde LSFMs (figuur 1A) waarin de y-as wordt gebruikt als een optie om embryo’s te “stapelen”. Ten eerste bieden we een fluorescerende microsfeergebaseerde kalibratierichtlijn voor op monsterkamers gebaseerde LSFMs, wat vooral belangrijk is voor instrumenten zonder kalibratieassistent. Ten tweede beschrijven we een montagemethode voor meerdere embryo’s op basis van de spinnenwebhouder28 (figuur 1B) die compatibel is met monsterrotatie en dus gelijktijdige beeldvorming van meerdere monsters in meerdere richtingen mogelijk maakt (figuur 1C). Verschillende embryo’s worden uitgelijnd op een dunne agarosefilm en, na inbrengen in de monsterkamer, achtereenvolgens door het lichtblad bewogen om driedimensionale beelden te verkrijgen. Ten derde bieden we drie voorbeeldige live imaging datasets voor Drosophila en voor Tribolium. Voor de eerste, we naast transgene lijnen met fluorescerend gelabelde kernen. Voor de laatste vergelijken we de prestaties van transgene sublijnen die hetzelfde transgeen dragen, maar op verschillende genomische locaties. Tot slot bespreken we het belang van parallellisatie met betrekking tot vergelijkende live beeldvorming en omgevingsafwijking33, bespreken we de doorvoerlimiet van ons experimentele kader en evalueren we de aanpassing van onze benadering van andere modelorganismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een van de exclusieve toepassingsgebieden van LSFMs is ontwikkelingsbiologie. In deze discipline is het van belang om naar levende exemplaren te kijken, anders kunnen morfogenetische processen niet op een dynamische manier worden beschreven. Een experimenteel kader voor de gelijktijdige live beeldvorming in op de steekproefkamer gebaseerde LSFM’s, zoals hier beschreven, is om twee belangrijke redenen handig.
Omgevingsafwijkingen, die onvermijdelijk zijn bij sequentiële live beeldvorming, kunn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Ernst H.K. Stelzer voor de mogelijkheid om zijn middelen te gebruiken, evenals zijn waardevolle opmerkingen over het manuscript, Anita Anderl voor ondersteuning met de Tribolium live imaging, Sven Plath voor technische ondersteuning, evenals Ilan Davis, Nicole Grieder en Gerold Schubiger voor het delen van hun transgene Drosophila-lijnen via het Bloomington Stock Center.
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
