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Biologie

Imagerie en direct simultanée d’embryons d’insectes multiples dans des microscopes à fluorescence à feuille de lumière à base de chambre d’échantillonnage

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61713
, ,
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF – MC),Goethe-Universität

Summary

La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière est l’outil le plus précieux en biologie du développement. Un problème majeur dans les études comparatives est la variance ambiante. Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée de plusieurs spécimens et, par conséquent, aborde cette question de manière proactive.

Abstract

La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière offre des solutions efficaces pour étudier des processus complexes à plusieurs échelles biologiquement pertinentes. Les configurations basées sur la chambre d’échantillonnage, qui sont spécialement conçues pour préserver l’intégrité tridimensionnelle de l’échantillon et comportent généralement une rotation de l’échantillon, sont le meilleur choix en biologie du développement. Par exemple, ils ont été utilisés pour documenter toute la morphogenèse embryonnaire de la mouche des fruits Drosophila melanogaster et du coléoptère rouge de la farine Tribolium castaneum. Cependant, de nombreux protocoles d’imagerie en direct disponibles ne fournissent que des cadres expérimentaux pour des embryons uniques. En particulier pour les études comparatives, de telles approches sont peu pratiques, car les spécimens estégés séquentiellement sont affectés par la variance ambiante. De plus, cela limite le nombre d’échantillons qui peuvent être analysés dans un délai donné. Nous fournissons un cadre expérimental pour l’imagerie simultanée en direct qui augmente le débit dans les configurations basées sur la chambre d’échantillonnage et garantit ainsi des conditions ambiantes similaires pour tous les échantillons. Tout d’abord, nous fournissons une directive d’étalonnage pour les microscopes à fluorescence à feuille de lumière. Deuxièmement, nous proposons une méthode de montage pour les embryons multiples qui soit compatible avec la rotation des échantillons. Troisièmement, nous fournissons des ensembles de données d’imagerie en direct tridimensionnelles exemplaires de Drosophila, pour lesquels nous juxtaposons trois lignées transgéniques avec des noyaux marqués par fluorescence, ainsi que de Tribolium, pour lequel nous comparons les performances de trois sous-lignées transgéniques qui portent le même transgène, mais à des emplacements génomiques différents. Notre protocole est spécialement conçu pour les études comparatives car il traite de manière proactive la variance ambiante, qui est toujours présente dans l’imagerie séquentielle en direct. Ceci est particulièrement important pour les analyses quantitatives et la caractérisation des phénotypes aberrationnels, qui résultent par exemple d’expériences knock-out. De plus, il augmente le débit global, ce qui est très pratique lorsque l’accès aux microscopes à fluorescence à feuille de lumière est limité. Enfin, la méthode de montage proposée peut être adaptée à d’autres espèces d’insectes et à d’autres organismes modèles, par exemple le poisson zèbre, sans aucun effort d’optimisation.

Introduction

La microscopie à fluorescence est l’une des techniques d’imagerie les plus essentielles dans les sciences de la vie, en particulier en biologie cellulaire et du développement. Dans les microscopes à fluorescence confocale1, qui sont à la pointe de la technologie pour l’imagerie par fluorescence tridimensionnelle depuis le milieu des années 1990, la même lentille est utilisée pour l’excitation des fluorophores et la détection de la lumière d’émission. Le faisceau laser d’éclairage excite tous les fluorophores le long de l’axe d’éclairage/détection et le signal de mise au point respectif est discriminé avant la détection par un trou d’épingle. Par conséquent, pour chaque image bidimensionnelle, l’ensemble du spécimen est illuminé. Par conséquent, pour chaque image tridimensionnelle, c’est-à-dire un empilement d’images bidimensionnelles spatialement consécutives, l’ensemble du spécimen est illuminé plusieurs dizaines à quelques centaines de fois2,ce qui favorise le photobleaching et la phototoxicité3.

Il y a près de vingt ans, la technologie à base de feuilles lumineuses4 est apparue comme une alternative prometteuse pour l’imagerie par fluorescence tridimensionnelle et est ainsi devenue un outil précieux en biologie du développement5. Dans cette approche, l’éclairage et la détection sont découplés. La lentille d’éclairage est utilisée pour générer une feuille de lumière d’une profondeur de seulement quelques micromètres dans le plan focal de la lentille de détection disposée perpendiculairement. Par conséquent, pour chaque image bidimensionnelle, seul un mince volume planaire autour du plan focal est éclairé. Par conséquent, pour chaque image tridimensionnelle, l’échantillon entier n’est éclairé qu’une seule fois, ce qui diminue fortement le photobleaching et la phototoxicité6. Pour cette raison, les microscopes à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) offrent des solutions efficaces pour étudier des processus complexes à de multiples échelles biologiquement pertinentes et sont, par conséquent, d’une valeur particulière en biologie du développement, où des échantillons aussi grands que plusieurs millimètres doivent être analysés au niveau subcellulaire.

Historiquement, les LSFM ont été échantillonnés à base de chambre7,8. Dans ces configurations, les axes d’éclairage (x) et de détection (z) sont généralement disposés perpendiculairement à l’axe de gravité (y). Les chambres d’échantillonnage offrent une grande liberté expérimentale. Tout d’abord, ils fournissent de grandes capacités tampons d’imagerie, ce qui facilite l’utilisation d’un système de perfusion pour contrôler l’environnement, par exemple, pour maintenir une température spécifiquede 9 ou pour appliquer des facteurs de stress biochimiques. De plus, ils prennent en charge des méthodes de montage personnalisées10 qui sont adaptées aux besoins expérimentaux respectifs tout en préservant l’intégrité tridimensionnelle, dans certains cas dynamique11,de l’échantillon. De plus, les configurations basées sur la chambre d’échantillonnage sont généralement équipées d’une fonction de rotation qui est utilisée pour faire tourner les échantillons autour de l’axe des y et ainsi les imager le long de deux, quatre ou même plus de directions. Puisque les embryons des organizations modèles couramment utilisées sont, dans le cadre de la microscopie, l’imagerie relativement grande et successive le long des axes ventral-dorsal, latéral, et/ou antérieur-postérieur de corps fournit une représentation plus complète. Cela permet par exemple un suivi à long terme des cellules qui se déplacent le long de chemins de migration tridimensionnels complexes12,13.

La microscopie à fluorescence à base de feuille de lumière a été largement appliquée pour étudier la morphogenèse embryonnaire de Drosophila melanogaster,à la fois systématiquement14,15 ainsi qu’avec un accent particulier sur les aspects biophysiques du développement. Par exemple, il a été utilisé pour recueillir des données morphogénétiques à haute résolution afin de détecter un lien biomécanique entre l’invagination de l’endoderme et l’extension de l’axe lors de l’allongement de la bande germinale16 et de relier davantage le flux cellulaire complexe avec des modèles de génération de force lors de la gastrulation17. Il a également été combiné avec d’autres techniques de pointe, par exemple, l’optogénétique pour étudier la régulation de la signalisation Wnt lors du modelage antérieur-postérieur dans l’épiderme18.

Cependant, l’étude d’une seule espèce ne permet pas de mieux comprendre l’évolution du développement. Pour comprendre l’embryogenèse dans le contexte phylogénétique, des recherches intensives ont été menées avec d’autres organismes modèles d’insectes. L’une des espèces les plus étudiées est le coléoptère rouge de la farine Tribolium castaneum,un ravageur des grains stocké économiquement pertinent19,dont la morphogenèse embryonnaire a également déjà été systématiquement étiquetée avec LSFM20. La morphogenèse embryonnaire de ces deux espèces diffère remarquablement à plusieurs égards, par exemple, le mode de segmentation21,ainsi que la formation et la dégradation de membranes extra-embryonnaires22. Ce dernier aspect a déjà fait l’objet d’une analyse approfondie à l’aide de LSFMs. Par exemple, il a été démontré que la séreuse, un tissu extra-embryonnaire qui enveloppe et protège l’embryon de Tribolium de divers dangers pour la majeure partie de son embryogenèse23,24,agit également comme le « moteur » morphogénétique de son propre processus de retrait lors de la fermeture dorsale25. De plus, il a été démontré que lors de la gastrulation, une région particulière du blastoderme reste ancrée à la membrane vitelline afin de créer des mouvements tissulaires asymétriques26 et, suite à cette observation, que la fluidisation tissulaire régionalisée permet aux cellules de quitter séquentiellement le bord du sérosa lors de la fermeture de la fenêtre du séreuse27.

Dans toutes les études associées à la drosophileet au triboliumcitées ci-dessus, des LSFM à base d’échantillons en chambre ont été utilisés. Dans la plupart des cas, les embryons ont été enregistrés dans plusieurs directions à l’aide de la fonction de rotation de l’échantillon. Bien que cela ne soit pas indiqué explicitement, on peut supposer qu’ils ont été enregistrés individuellement et donc indépendants les uns des autres dans des tests d’imagerie en direct séquentiels, similaires à nos travaux précédents sur Tribolium20,28. Dans certains scénarios, une telle approche est acceptable, mais surtout dans les approches comparatives quantitatives, la variance ambiante peut fausser les résultats. Par exemple, on sait depuis longtemps que la vitesse de développement des insectes dépend de la température29, mais une étude plus récente suggère en outre que chez la drosophile, la température peut également affecter la concentration de morphogènes30. Par conséquent, si certaines caractéristiques de l’embryogenèse, par exemple les proportions dynamiques, les taux de division et les vitesses de migration des cellules, doivent être quantifiées avec précision, des répétitions suffisantes sans variance ambiante sont nécessaires. Cela minimise les écarts types et les erreurs types, ce qui facilite la juxtaposition avec d’autres conditions expérimentales, même marginalement divergentes.

Cependant, les LSFM à base de chambre d’échantillonnage sont principalement conçus pour des tests à haute teneur plutôt que pour des tests à haut débit. Contrairement aux microscopes confocaux, qui sont généralement équipés de mécanismes de serrage normalisés pour les lames de microscopie, les boîtes de Petri et les plaques de puits, presque tous les LSFM à base de chambre d’échantillonnage utilisent des mécanismes de serrage à base de cylindres. Ces mécanismes sont destinés aux porte-échantillons sur mesure qui sont compatibles avec la rotation ainsi que non invasifs10,mais généralement non conçus pour plus d’un échantillon20,31,32. Un cadre pour l’imagerie simultanée en direct de deux embryons ou plus, dans lequel les avantages des configurations basées sur la chambre d’échantillonnage ne sont pas compromis, résout le problème de la variance ambiante, augmentant ainsi la valeur des LSFM pour les études comparatives.

Dans notre protocole, nous présentons un cadre expérimental pour l’imagerie comparative en direct dans des LSFM à base de chambres d’échantillonnage (Figure 1A) dans lequel l’axe des y est utilisé comme option pour « empiler » des embryons. Tout d’abord, nous fournissons une directive d’étalonnage basée sur la microsphère fluorescente pour les LSFM basés sur une chambre d’échantillonnage, ce qui est particulièrement important pour les instruments qui ne disposent pas d’un assistant d’étalonnage. Deuxièmement, nous décrivons un procédé de montage pour embryons multiples basé sur le support de toile d’araignée28 (figure 1B)qui est compatible avec la rotation des échantillons et permet ainsi l’imagerie simultanée de plusieurs échantillons dans plusieurs directions(figure 1C). Plusieurs embryons sont alignés sur un mince film d’agarose et, après insertion dans la chambre d’échantillonnage, déplacés successivement à travers la feuille de lumière pour acquérir des images tridimensionnelles. Troisièmement, nous fournissons trois ensembles de données d’imagerie en direct exemplaires pour la drosophile ainsi que pour Tribolium. Pour le premier, nous juxtaposons des lignées transgéniques avec des noyaux marqués par fluorescence. Pour ce dernier, nous comparons les performances des sous-lignées transgéniques qui portent le même transgène, mais à des endroits génomiques différents. Enfin, nous discutons de l’importance de la parallélisation en ce qui concerne l’imagerie en direct comparative et la variance ambiante33,débattons de la limite de débit de notre cadre expérimental et évaluons l’adaptation de notre approche à d’autres organismes modèles.

Protocol

1. Travaux préparatoires Choisissez une combinaison lentille d’éclairage / lentille de détection / caméra pour le LSFM qui convient à la question scientifique et configurez le microscope. La taille du champ de vision est le quotient de la taille de la puce de la caméra et le grossissement de l’objectif de détection. La lentille d’éclairage doit être choisie de telle sorte que tout le champ de vision soit recouvert d’une feuille lumineuse à peu près plane34. Trois combi…

Representative Results

Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct par fluorescence comparative dans des LSFM à base de chambre d’échantillonnage. Par exemple, le cadre peut être utilisé pour juxtaposer (i) des embryons de deux espèces ou plus, (ii) des embryons de lignées dans lesquelles un ou plusieurs gènes sont éliminés plus des contrôles de type sauvage, (iii) des embryons multiples de la même lignée transgénique, (iv) des embryons de lignées transgéniques différentes, ou (v) des embryons d…

Discussion

L’un des domaines d’application exclusifs des LSFM est la biologie du développement. Dans cette discipline, il est important d’examiner les spécimens vivants, sinon les processus morphogénétiques ne peuvent pas être décrits de manière dynamique. Un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée dans des LSFM à base de chambre d’échantillonnage, comme décrit ici, est pratique pour deux raisons principales.

La variance ambiante, qui est inévitable dans l’imageri…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Ernst H. K. Stelzer pour l’occasion d’utiliser ses ressources ainsi que ses précieux commentaires concernant le manuscrit, Anita Anderl pour son soutien avec l’imagerie en direct Tribolium, Sven Plath pour son soutien technique ainsi qu’Ilan Davis, Nicole Grieder et Gerold Schubiger pour avoir partagé leurs lignées de drosophiles transgéniques via le Bloomington Stock Center.

Materials

6-well plate Orange Scientific 4430500  
24-well plate Orange Scientific 4430300 Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish Fisher Scientific 153066 Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish Fisher Scientific L9004575
100-µm mesh size cell strainer BD Biosciences 352360
250-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-038 Only for live imaging involving Tribolium
300-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-040 Only for live imaging involving Tribolium
710-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-050 Only for live imaging involving Tribolium
800-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-051 Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour Demeter e.V. SP061006 Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium Genesee Scientific 66-115 Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø Thermo Fisher Scientific T7282
inactive dry yeast Genesee Scientific 62-108 Only for live imaging involving Tribolium
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
narrow vials Genesee Scientific 32-109 Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush VWR International 149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl Carl Roth 9062.3 Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour Demeter e.V. SP061036 Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials Genesee Scientific 32-110 Only for live imaging involving Drosophila
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References

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Citer Cet Article
Ratke, J., Krämer, F., Strobl, F. Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes. J. Vis. Exp. (163), e61713, doi:10.3791/61713 (2020).
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