JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61713
, ,
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF – MC),Goethe-Universität

Summary

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

Abstract

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מבוססת יריעות אור מציעה פתרונות יעילים לחקר תהליכים מורכבים בכמה קשקשים רלוונטיים ביולוגית. הגדרות מבוססות תא לדוגמה, אשר תוכננו במיוחד כדי לשמר את השלמות התלת מימדית של הדגימה ובדרך כלל כוללות סיבוב מדגם, הן הבחירה הטובה ביותר בביולוגיה התפתחותית. למשל, הם שימשו כדי לתעד את כל מורפוגנזה עוברית של זבוב הפירות Drosophila melanogaster ואת חיפושית הקמח האדום Tribolium castaneum. עם זאת, פרוטוקולי הדמיה חיים זמינים רבים מספקים רק מסגרות ניסיוניות לעוברים בודדים. במיוחד עבור מחקרים השוואתיים, גישות כאלה אינן נוחות, שכן דגימות בתמונה רציפה מושפעות מהשונות הסביבתית. כמו כן, זה מגביל את מספר הדגימות שניתן לציין בתוך זמן נתון. אנו מספקים מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית המגבירה את התפוקה בהגדרות מבוססות תא מדגמי ובכך מבטיחה תנאי סביבה דומים לכל הדגימות. ראשית, אנו מספקים קו מנחה לכיול עבור מיקרוסקופים פלואורסצנטיים של יריעות אור. שנית, אנו מציעים שיטת הרכבה עבור עוברים מרובים התואמת לסיבוב מדגם. שלישית, אנו מספקים מודלים תלת מימדיים למופת של הדמיה חיה של Drosophila, שעבורם אנו ממקמים שלושה קווים מהונדסים עם גרעינים מתויגים פלואורסצנטיים, כמו גם של טריבוליום, שעבורו אנו משווים את הביצועים של שלושה קווי משנה מהונדסים הנושאים את אותו טרנסג’ין, אך במקומות גנומיים שונים. הפרוטוקול שלנו תוכנן במיוחד למחקרים השוואתיים מכיוון שהוא מטפל באופן פעיל בשונות הסביבה, שתמיד קיימת בהדמיה חיה רציפה. זה חשוב במיוחד לניתוחים כמותיים ואפיון של פנוטיפים חריגים, הנובעים למשל מניסויי נוקאאוט. כמו כן, הוא מגדיל את התפוקה הכוללת, וזה מאוד נוח כאשר הגישה למיקרוסקופים פלואורסצנטיים יריעות אור מוגבלת. לבסוף, שיטת ההרכבה המוצעת יכולה להיות מותאמת עבור מיני חרקים אחרים ואורגניזמים מודל נוסף, למשל, זברה, עם בעצם שום מאמץ אופטימיזציה.

Introduction

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא אחת מטכניקות ההדמיה החיוניות ביותר במדעי החיים, במיוחד בביולוגיה התאית וההתפתחותית. במיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקאליים1, שהם המדינה-of-the-art עבור הדמיית פלואורסצנטיות תלת מימדית מאז אמצע שנות התשעים, אותה עדשה משמשת עבור עירור פלואורופור וזיהוי אור פליטה. קרן הלייזר לתאורה מרגשת את כל הפלואורופורים לאורך ציר התאורה/זיהוי והאות המופרך בהתאמה מופלה לפני הגילוי על ידי חור סיכה. לפיכך, עבור כל תמונה דו מימדית, כל הדגימה מוארת. כתוצאה מכך, עבור כל תמונה תלת מימדית, כלומר, ערימה של תמונות דו מימדיות רצופות, הדגימה כולה מוארת כמה עשרות עד כמה מאות פעמים2, אשר מקדם photobleaching ו phototoxicity3.

לפני כמעט עשרים שנה, טכנולוגיה מבוססת יריעות אור4 התגלתה כחלופה מבטיחה להדמיית פלואורסצנטיות תלת מימדית ובכך הפכה לכלי רב ערך בביולוגיה התפתחותית5. בגישה זו, תאורה וזיהוי הם decoupled. עדשת התאורה משמשת ליצירת יריעת אור בעומק של מיקרומטרים בודדים בלבד במישור המוקד של עדשת הגילוי המאורגמת בניצב. לפיכך, עבור כל תמונה דו מימדית, רק נפח מישורי דק סביב מישור המוקד מואר. כתוצאה מכך, עבור כל תמונה תלת מימדית, הדגימה כולה מוארת רק פעם אחת, אשר מקטין מאוד photobleaching ו phototoxicity6. מסיבה זו, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים של יריעות אור (LSFMs) מציעים פתרונות יעילים לחקר תהליכים מורכבים בכמה קשקשים רלוונטיים ביולוגית והם, אם כן, בעלי ערך מיוחד בביולוגיה התפתחותית, שבה דגימות גדולות כמו כמה מילימטרים יש לנתח ברמה התת-תאית.

מבחינה היסטורית, LSFMs כבר מדגם תא מבוסס7,8. בהגדרות אלה, צירי התאורה (x) והזיהוי (z) מסודרים בדרך כלל בניצב לציר הכבידה (y). תאי מדגם מציעים חופש ניסיוני בשפע. ראשית, הם מספקים קיבולות חיץ הדמיה גדולות, אשר בתורו מקל על השימוש במערכת זלוף כדי לשלוט בסביבה, למשל, כדי לשמור על טמפרטורה מסוימת9 או ליישם גורמי לחץ ביוכימיים. כמו כן, הם תומכים בשיטות הרכבה מותאמות אישית10 המותאמות לצרכים הניסיוניים המתאימים תוך שמירה על תלת מימד, במקרים מסוימים דינמי11, שלמות הדגימה. בנוסף, הגדרות מבוססות תא מדגם מצוידות בדרך כלל בפונקציית סיבוב המשמשת לסובב את הדגימות סביב ציר y ובכך לדמות אותם לאורך שניים, ארבעה או אפילו יותר כיוונים. מאז עוברים של אורגניזמים מודל נפוץ הם, בהקשר של מיקרוסקופיה, גדול יחסית, הדמיה רצופה לאורך גחון הגב, לרוחב, ו / או צירי גוף אחוריים מספק ייצוג מקיף יותר. זה מאפשר למשל מעקב ארוך טווח אחר תאים שזזים לאורך נתיבי העברה תלת מימדיים מורכבים12,13.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס גיליון אור יושם בהרחבה כדי לחקור את המורפוגנזה העוברית של Drosophila melanogaster, הן באופן שיטתי14,15, כמו גם עם דגש ספציפי על ההיבטים הביופיזיים של הפיתוח. לדוגמה, הוא שימש לאיסוף נתונים מורפוגנטיים ברזולוציה גבוהה על מנת לזהות קשר ביומכני בין פולשניות אנדודרם והרחבת ציר במהלך התארכות חיידקים16 ועוד כדי לקשר את הזרימה התאית המורכבת עם דפוסי יצירת כוח במהלך gastrulation17. זה גם שולב עם טכניקות המדינה-of-the-art אחרים, למשל, אופטוגנטיקה כדי לחקור את הרגולציה של איתות Wnt במהלך דפוס אחורי-ראשי באפידרמיס18.

עם זאת, לימוד מין אחד בלבד אינו מספק תובנות על התפתחות ההתפתחות. כדי להבין עובריות בהקשר הפילוגנטי, נערך מחקר אינטנסיבי עם אורגניזמים חלופיים של מודל חרקים. אחד המינים הנחקרים ביותר הוא חיפושית הקמח האדום טריבוליום קסטנאום, מזיק תבואה מאוחסן רלוונטי מבחינה כלכלית19, אשר מורפוגנזה עוברית כבר דימוי שיטתי עם LSFM20. המורפוגנזה העוברית של שני מינים אלה שונה להפליא בכמה היבטים, למשל, מצב פילוח21, כמו גם היווצרות והשפלה של ממברנות חוץ-עובריות22. ההיבט האחרון כבר נותח בהרחבה באמצעות LSFMs. לדוגמה, הוכח כי סרוסה, רקמה עוברית נוספת העוטפת ומגנה על עובר הטריבוליום מפני סכנות שונות עבור החלק הטוב יותר של העובר שלה23,24, משמש גם “נהג” מורפוגנטי עבור תהליך הנסיגה שלה במהלך סגירת הגב25. יתר על כן, הוכח כי במהלך gastrulation, אזור מסוים של blastoderm נשאר מעוגן קרום vitelline על מנת ליצור תנועות רקמה אסימטרית26 ו, בעקבות תצפית זו, כי נזילות רקמות אזורית מאפשרת לתאים לעזוב ברצף את קצה הסרוסה במהלך סגירת חלון סרוסה27.

בכל Drosophila– ו טריבוליוםהקשורים מחקרים שצוטטו לעיל, LSFMs מבוססי תא מדגם שימשו. ברוב המקרים, העוברים נרשמו בכיוונים מרובים באמצעות פונקציית הסיבוב לדוגמה. אמנם לא צוין במפורש, ניתן להניח כי הם נרשמו בנפרד ובכך עצמאי אחד את השני מבחני הדמיה חיים רציפים, בדומה לעבודה הקודמת שלנו על Tribolium20,28. בתרחישים מסוימים, גישה כזו מקובלת, אך במיוחד בגישות השוואתיות כמותיות, שונות סביבתית יכולה לעוות את התוצאות. לדוגמה, זה זמן רב ידוע כי המהירות ההתפתחותית של חרקים הוא תלוי טמפרטורה29, אבל מחקר עדכני יותר עולה כי ב Drosophila, הטמפרטורה עשויה להשפיע גם על הריכוז של מורפוגנים30. כתוצאה מכך, אם מאפיינים מסוימים של עובר, למשל, הפרופורציות הדינמיות, שיעורי החלוקה ומהירויות ההגירה של התאים, צריכים להיות מכמתים במדויק, נדרשות חזרות מספיקות ללא שונות סביבתית. זה ממזער סטיות תקן ושגיאות תקן, אשר בתורו מקל על הסמיכות עם תנאים ניסיוניים אחרים, אפילו רק שוליים שונים.

עם זאת, LSFMs מבוססי תא לדוגמה מיועדים בעיקר לתוכן גבוה ולא למאמרי תפוקה גבוהים. שלא כמו מיקרוסקופים קונפוקליים, אשר מצוידים בדרך כלל עם מנגנוני הידוק סטנדרטיים עבור שקופיות מיקרוסקופיה, צלחות פטרי וצלחות היטב, כמעט כל LSFMs מבוססי תא מדגם להשתמש במנגנוני הידוק מבוססי גליל. מנגנונים אלה מיועדים למחזיקי מדגם בהתאמה אישית התואמים לסיבוב כמו גם10לא פולשניים , אך בדרך כלל אינם מיועדים ליותר מדגם אחד20,31,32. מסגרת להדמיה חיה בו זמנית של שני עוברים או יותר, שבה היתרונות של הגדרות מבוססות תא מדגם אינם נפגעים, מטפלת בבעיית השונות הסביבתית ובכך מגדילה את הערך של LSFMs למחקרים השוואתיים.

בפרוטוקול שלנו, אנו מציגים מסגרת ניסיונית להדמיה חיה השוואתית ב- LSFMs מבוססי תא מדגם (איור 1A) שבה ציר y משמש כאפשרות “לערום” עוברים. ראשית, אנו מספקים הנחיית כיול מבוססת מיקרוספרה פלואורסצנטית עבור LSFMs מבוססי תא מדגם, וזה חשוב במיוחד עבור מכשירים שאין להם עוזר כיול. שנית, אנו מתארים שיטת הרכבה לעוברים מרובים המבוססת על מחזיק קורי העכביש28 (איור 1B)התואמת לסיבוב הדגימה ובכך מאפשרת הדמיה בו זמנית של דגימות מרובות בכיוונים מרובים (איור 1C). מספר עוברים מיושרים על גבי סרט agarose דק, ולאחר הכניסה לתוך תא המדגם, עבר ברציפות דרך גיליון האור כדי לרכוש תמונות תלת מימדיות. שלישית, אנו מספקים שלוש ערכות נתונים הדמיה חיה למופת עבור Drosophila, כמו גם עבור טריבוליום. עבור הראשון, אנו ממקסמים קווים מהונדסים עם גרעינים בעלי תווית פלואורסצנטית. עבור האחרון, אנו משווים את הביצועים של קווי משנה מהונדסים הנושאים את אותו טרנסג’ין, אך במקומות גנומיים שונים. לבסוף, אנו דנים בחשיבות ההקבלה ביחס להדמיה חיה השוואתית ושונותסביבתית 33, דנים במגבלת התפוקה של המסגרת הניסיונית שלנו ומעריכים את התאמת הגישה שלנו לאורגניזמים מודל אחרים.

Protocol

1. עבודת הכנה בחר עדשת תאורה / זיהוי עדשה / שילוב מצלמה עבור LSFM שמתאים לשאלה המדעית ולהגדיר את המיקרוסקופ. גודל שדה הראייה הוא המנה של גודל שבב המצלמה והגדלת עדשת הגילוי. יש לבחור בעדשת התאורה כך שכל שדה הראייה יכסה על ידי גיליון אור מישורי גס34. שלושה שילובים מומלצים מפורטי?…

Representative Results

הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה פלואורסצנטית השוואתית בתא מדגם מבוסס LSFMs. לדוגמה, ניתן להשתמש במסגרת כדי לחבר (i) עוברים משני מינים או יותר, (ii) עוברים של קווים שבהם גנים אחד או יותר מופקים בתוספת פקדים מסוג בר, (iii) עוברים מרובים מאותו קו מהונדס, (iv) עוברים מקווים מהונדסים שונים, ?…

Discussion

אחד מאזורי היישום הבלעדיים של LSFMs הוא ביולוגיה התפתחותית. במשמעת זו, יש חשיבות להסתכל על דגימות חיות, אחרת לא ניתן לתאר תהליכים מורפוגנטיים באופן דינמי. מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית ב- LSFMs מבוססי תא מדגם, כמתואר כאן, נוחה משתי סיבות עיקריות.

ניתן לטפל בשונות הסביבה, שהיא …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לארנסט ה. ק. סטלייזר על ההזדמנות להשתמש במשאביו, כמו גם להערותיו החשובות בנוגע לכתב היד, אניטה אנדרול על תמיכתה בהדמיה החיה של טריבוליום, סוון פלאת’ על התמיכה הטכנית, כמו גם לאילן דייוויס, ניקול גריידר וג’רולד שוביגר על שיתוף קווי הדרוסופלה המהונדסים שלהם דרך מרכז המניות בלומינגטון.

Materials

6-well plate Orange Scientific 4430500  
24-well plate Orange Scientific 4430300 Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish Fisher Scientific 153066 Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish Fisher Scientific L9004575
100-µm mesh size cell strainer BD Biosciences 352360
250-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-038 Only for live imaging involving Tribolium
300-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-040 Only for live imaging involving Tribolium
710-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-050 Only for live imaging involving Tribolium
800-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-051 Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour Demeter e.V. SP061006 Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium Genesee Scientific 66-115 Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø Thermo Fisher Scientific T7282
inactive dry yeast Genesee Scientific 62-108 Only for live imaging involving Tribolium
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
narrow vials Genesee Scientific 32-109 Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush VWR International 149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl Carl Roth 9062.3 Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour Demeter e.V. SP061036 Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials Genesee Scientific 32-110 Only for live imaging involving Drosophila
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
  3. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
  4. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
  6. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
  7. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  8. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  9. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
  10. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
  11. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  12. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
  13. Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
  14. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  15. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  16. Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
  17. Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
  18. Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
  19. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  20. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
  21. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
  22. Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
  23. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
  24. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
  25. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
  26. Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
  27. Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
  28. Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
  29. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
  30. Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
  31. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
  32. Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
  33. Mcdonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , (2013).
  34. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
  35. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  36. Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
  37. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
  38. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  39. vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
  40. Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
  41. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
  42. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  43. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
  44. He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
  45. Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
  46. Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
  47. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , (1997).
  48. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
  49. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
  50. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
  51. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
  52. Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
  53. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  54. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  55. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
  56. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
  57. Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
  58. Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
  59. Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
  60. Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
  61. Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).

Tags

Keywords: Light Sheet Fluorescence MicroscopySample ChamberCobweb HolderFluorescent MicrospheresEmbryo DechorionationSimultaneous Live ImagingHigh Content ImagingCalibrationAxial Resolution
check_url/fr/61713?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ratke, J., Krämer, F., Strobl, F. Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes. J. Vis. Exp. (163), e61713, doi:10.3791/61713 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image