Одновременное живое изображение нескольких эмбрионов насекомых в образец камерного листа флуоресценции микроскопов

Summary

Флуоресцентная микроскопия на основе легкого листа является наиболее ценным инструментом в биологии развития. Одной из основных проблем в сравнительных исследованиях является разница в окружающей среде. Наш протокол описывает экспериментальную основу для одновременного живого изображения нескольких образцов и, следовательно, решает этот вопрос про-активно.

Abstract

Флуоресцентная микроскопия на основе светового листа предлагает эффективные решения для изучения сложных процессов в нескольких биологически релевантных масштабах. Образцы камерных установок, которые специально разработаны для сохранения трехмерной целостности образца и обычно имеют вращение образца, являются лучшим выбором в биологии развития. Например, они были использованы для документирования всего эмбрионального морфогенеза плодовой мухи Drosophila melanogaster и красной муки жука Tribolium castaneum. Тем не менее, многие доступные протоколы живой визуализации обеспечивают только экспериментальные рамки для отдельных эмбрионов. Специально для сравнительных исследований такие подходы неудобны, так как последовательно изображенные образцы страдают от дисперсии окружающей среды. Кроме того, это ограничивает количество образцов, которые могут быть просасылись в течение данного времени. Мы предоставляем экспериментальную основу для одновременного живого изображения, что увеличивает пропускную способность в образца камеры на основе установок и, таким образом, обеспечивает аналогичные условия окружающей среды для всех образцов. Во-первых, мы предоставляем рекомендации по калибровке световых листов флуоресцентных микроскопов. Во-вторых, мы предлагаем монтажный метод для нескольких эмбрионов, который совместим с вращением образца. В-третьих, мы предоставляем образцовые трехмерные наборы данных живой визуализации Drosophila, для которых мы сопоставляем три трансгенные линии с флуоресцентно помеченными ядрами, а также Tribolium, для которых мы сравниваем производительность трех трансгенных подлин, которые несут тот же трансген, но в разных геномных местах. Наш протокол специально разработан для сравнительных исследований, так как он активно устраняет дисперсию окружающей среды, которая всегда присутствует в последовательной живой визуализации. Это особенно важно для количественного анализа и характеристики аберрологических фенотипов, которые являются результатом, например, нокаут-экспериментов. Кроме того, это увеличивает общую пропускную способность, что очень удобно, когда доступ к световым микроскопам флуоресценции листа ограничен. Наконец, предлагаемый метод монтажа может быть адаптирован для других видов насекомых и дальнейшей модели организмов, например, зебры, практически без оптимизации усилий.

Introduction

Флуоресценция микроскопии является одним из наиболее важных методов визуализации в науке о жизни, особенно в клеточной и биологии развития. В конфокальных флуоресценции^{микроскопов 1}, которые являются самыми художественными для трехмерной флуоресценции изображения с середины 1990-х годов, тот же объектив используется для флюорофора возбуждения и обнаружения излучения света. Лазерный луч освещения возбуждает все фторфоры вдоль оси освещения/обнаружения, и соответствующий внефокусный сигнал подвергается дискриминации до обнаружения пинхолом. Следовательно, для каждого двумерного изображения весь образец освещается. Следовательно, для каждого трехмерного изображения, т.е. стопки пространственно последовательных двумерных изображений, весь образец освещается от нескольких десятков^{до нескольких сотен раз 2}, что способствует фотоотчету и фототоксичности³.

Почти двадцать лет назад технология на основе светового^{листа 4 стала} перспективной альтернативой трехмерной флуоресцентной визуализации и, таким образом, стала ценным инструментом в^{биологии развития 5.} При этом подходе освещение и обнаружение разъединяются. Объектив освещения используется для создания светового листа с глубиной всего в несколько микрометров в фокусной плоскости перпендикулярно устроенной линзы обнаружения. Таким образом, для каждого двумерного изображения освещается только тонкий планарный объем вокруг фокусной плоскости. Следовательно, для каждого трехмерного изображения, весь образец освещается только один раз, что сильно уменьшает фотоотчет и фототоксичность⁶. По этой причине флуоресцентные микроскопы светового листа (LSFMs) предлагают эффективные решения для изучения сложных процессов в нескольких биологически релевантных масштабах и, следовательно, имеют особую ценность в биологии развития, где образцы шириной до нескольких миллиметров должны быть проанализированы на субклеточном уровне.

Исторически сложилось так, LSFMs были образца камеры^{основе 7,8}. В этих установках, освещение (x) и обнаружение (z) осей, как правило, расположены перпендикулярно оси тяжести (y). Образцы камер предлагают широкие экспериментальные свободы. Во-первых, они обеспечивают большие буферные возможности изображения, что, в свою очередь, облегчает использование перфузионной системы для контроля окружающей среды, например,^{для поддержания определенной температуры 9} или применения биохимических стрессоров. Кроме того, они поддерживают индивидуальные^{методы монтажа 10,} которые адаптированы к соответствующим экспериментальным потребностям, сохраняя при этом трехмерную, в^{некоторых случаях динамическую 11,}целостность образца. Кроме того, установки на основе выборочных камер обычно оснащены функцией вращения, которая используется для вращения образцов вокруг оси y и, таким образом, изображения их по двум, четырем или даже более направлениям. Поскольку эмбрионы широко используемых модельных организмов в контексте микроскопии являются относительно большими, последовательными изображениями вдоль брюшной спинной, боковой и/или передней-задней оси тела обеспечивает более полное представление. Это позволяет, например, долгосрочное отслеживание ячеек, которые движутся по сложным трехмерным путям^{миграции 12,13.}

Свет лист на основе флуоресценции микроскопии была широко применена для изучения эмбрионального морфогенеза Drosophila меланогастер,^{как систематически 14},^15, а также с конкретным акцентом на биофизические аспекты развития. Например, он был использован для сбора морфогенетических данных высокого разрешения для того, чтобы обнаружить биомеханическую связь между эндодермом инагинацией и расширением оси во время^{удлинением зародышевой полосы 16 и далее,} чтобы связать сложный клеточный поток с шаблонами генерации силы во время гастрипуляции¹⁷. Он также был объединен с другими самыми новыми методами, например, оптогенетика для исследования регулирования сигнализации Wnt во время переднего заднего узора в эпидермис¹⁸.

Однако изучение только одного вида не дает понимания эволюции развития. Для понимания эмбриогенеза в филогенетического контекста были проведены интенсивные исследования с альтернативными организмами моделей насекомых. Одним из наиболее всесторонне исследованных видов является красная мука жука Tribolium castaneum, экономически значимых хранится^{вредитель зерна 19}, чей эмбриональный морфогенез также уже систематически изображены с LSFM²⁰. Эмбриональный морфогенез этих двух видов заметно отличается в нескольких аспектах, например,^{режимом сегментации 21,}а также образованием и деградацией внемуникальных мембран^22. Последний аспект уже был тщательно проанализирован с использованием LSFMs. Например, было показано, что сероза, экстра-эмбриональной ткани, которая окутывает и защищает эмбрион Tribolium от различных опасностей для большей части его эмбриогенез^23,24, также выступает в качестве морфогенетической “драйвер” для своего собственного процесса вывода во время^{спинного закрытия 25}. Кроме того, было продемонстрировано, что во время гастрипуляции, определенная область бластодерма остается на якоре к вителлиновой мембране для того, чтобы^{создать асимметричные движения тканей 26} и, после этого наблюдения, что регионализованная жидкость тканей позволяет клеткам последовательно покинуть серозу края во время закрытия^{сероза окна 27}.

Во всех Дрозофила– и Tribolium -ассоциированныхисследований, упомянутых выше, образец камеры основе LSFMs были использованы. В большинстве случаев эмбрионы были записаны по нескольким направлениям с использованием функции вращения образца. Хотя это и не указано прямо, можно предположить, что они были записаны индивидуально и, таким образом, независимо друг от друга в последовательных живых анализов изображений, похожие на нашу предыдущую работу на Tribolium^20,28. В некоторых сценариях такой подход является приемлемым, но особенно в количественных сравнительных подходах, эмбиентная дисперсия может исказить результаты. Например, уже давно известно, что скорость развития насекомых зависит^{от температуры 29}, но более поздние исследования далее предполагает, что в Drosophila, температура может также повлиять на концентрацию^{морфогенов 30}. Следовательно, если определенные характеристики эмбриогенеза, например, динамические пропорции, скорость деления и скорость миграции клеток, должны быть точно количественно, достаточно повторений без эмбиентной дисперсии не требуется. Это сводит к минимуму стандартные отклонения и стандартные ошибки, что, в свою очередь, облегчает сопоставление с другими, даже незначительно расходящимися экспериментальными условиями.

Тем не менее, выборка камерных LSFMs в первую очередь предназначены для высокого содержания, а не высокой пропускной способности анализов. В отличие от конфокальных микроскопов, которые обычно оснащены стандартизированными механизмами зажима для микроскопии слайдов, чашек Петри и хорошо пластин, почти все образцы камеры на основе LSFMs использовать цилиндр основе зажима механизмов. Эти механизмы предназначены для заказных держателей образцов, которые совместимы с вращением, а также^{неинвазивные 10,}но обычно не предназначены для^{более чем одного образца 20,31,32}. Рамки для одновременной живой визуализации двух или более эмбрионов, в которых преимущества установки на основе выборочных камер не скомпрометированы, решает проблему дисперсии окружающей среды, тем самым повышая ценность LSFMs для сравнительных исследований.

В нашем протоколе мы представляем экспериментальную основу для сравнительной живой визуализации в образец камеры на основе LSFMs(рисунок 1A), в котором у оси используется в качестве опции для “стек” эмбрионов. Во-первых, мы предоставляем флуоресцентные микросферные калибровочные рекомендации для образцовых камерных LSFMs, что особенно важно для приборов, не имеют ассистента калибровки. Во-вторых, мы описываем метод монтажа для нескольких эмбрионов на^{основе держателя паутины 28} (рисунок 1B), который совместим с вращением образца и, таким образом, позволяет одновременное изображение нескольких образцов по нескольким направлениям(рисунок 1C). Несколько эмбрионов выровнены поверх тонкой агарозной пленки и, после вставки в образец камеры, переехал последовательно через световой лист, чтобы приобрести трехмерные изображения. В-третьих, мы предоставляем три образцовых живых наборов данных изображений для Drosophila, а также для Tribolium. Для первых мы сопоставляем трансгенные линии с флуоресцентно помеченными ядрами. Для последних мы сравниваем производительность трансгенных подлин, которые имеют один и тот же трансген, но в разных геномных местах. Наконец, мы обсуждаем важность параллелизации в отношении сравнительной живой визуализации^{и дисперсии окружающей среды 33}, обсуждаем предел пропускной способности наших экспериментальных рамок и оцениваем адаптацию нашего подхода к другим моделью организмов.

Protocol

1. Подготовительная работа Выберите объектив освещения / обнаружение объектива / камеры сочетание для LSFM, который подходит научный вопрос и настроить микроскоп. Размер поля зрения является фактором размера чипа камеры и увеличения объектива обнаружения. Объектив освещения должен…

Representative Results

Наш протокол описывает экспериментальную основу для сравнительной флуоресценции живой визуализации в образец камеры на основе LSFMs. Например, эта структура может быть использована для сопоставления (i) эмбрионов двух или более видов, ii) эмбрионов линий, в которых один или несколько гено?…

Discussion

Одной из областей исключительного применения LSFMs является биология развития. В этой дисциплине важно смотреть на живые образцы, иначе морфогенетические процессы не могут быть описаны динамически. Экспериментальная основа для одновременного живого изображения в образцах камерных LSFMs,…

Materials

6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300	Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	153066	Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	L9004575
100-µm mesh size cell strainer	BD Biosciences	352360
250-µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-038	Only for live imaging involving Tribolium
300-µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-040	Only for live imaging involving Tribolium
710-µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-050	Only for live imaging involving Tribolium
800-µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-051	Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	SP061006	Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium	Genesee Scientific	66-115	Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
inactive dry yeast	Genesee Scientific	62-108	Only for live imaging involving Tribolium
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
narrow vials	Genesee Scientific	32-109	Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush	VWR International	149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl	Carl Roth	9062.3	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour	Demeter e.V.	SP061036	Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials	Genesee Scientific	32-110	Only for live imaging involving Drosophila