Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane
Summary
Questo protocollo fornisce strumenti sperimentali in vitro per valutare la trasformazione delle cellule mammarie umane. Vengono descritti i passaggi dettagliati per seguire il tasso di proliferazione cellulare, la capacità di crescita indipendente dall’ancoraggio e la distribuzione di lignaggi cellulari in colture 3D con matrice di membrana basale.
Abstract
La tumorigenesi è un processo in più fasi in cui le cellule acquisiscono capacità che consentono la loro crescita, sopravvivenza e diffusione in condizioni ostili. Diversi test cercano di identificare e quantificare questi tratti distintivi delle cellule cancerose; tuttavia, spesso si concentrano su un singolo aspetto della trasformazione cellulare e, di fatto, sono necessari più test per la loro corretta caratterizzazione. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire ai ricercatori una serie di strumenti per valutare la trasformazione cellulare in vitro da un’ampia prospettiva, consentendo così di trarre conclusioni valide.
Un’attivazione prolungata della segnalazione proliferativa è la caratteristica principale dei tessuti tumorali e può essere facilmente monitorata in condizioni in vitro calcolando il numero di raddoppi della popolazione raggiunti nel tempo. Inoltre, la crescita delle cellule nelle colture 3D consente la loro interazione con le cellule circostanti, simile a ciò che accade in vivo. Ciò consente la valutazione dell’aggregazione cellulare e, insieme all’etichettatura immunofluorescente di marcatori cellulari distintivi, di ottenere informazioni su un’altra caratteristica rilevante della trasformazione tumorale: la perdita di una corretta organizzazione. Un’altra caratteristica notevole delle cellule trasformate è la loro capacità di crescere senza attaccamento ad altre cellule e alla matrice extracellulare, che può essere valutata con il saggio di ancoraggio.
Vengono fornite procedure sperimentali dettagliate per valutare il tasso di crescita cellulare, per eseguire l’etichettatura immunofluorescente dei marcatori di lignaggio cellulare nelle colture 3D e per testare la crescita delle cellule indipendenti dall’ancoraggio nell’agar morbido. Queste metodologie sono ottimizzate per le cellule epiteliali primarie del seno (BPEC) a causa della sua rilevanza nel cancro al seno; tuttavia, le procedure possono essere applicate ad altri tipi di celle dopo alcune regolazioni.
Introduction
Sono necessari più eventi successivi per lo sviluppo della neoplasia. Nel 2011, Hanahan e Weinberg hanno descritto 10 capacità che consentono la crescita, la sopravvivenza e la diffusione delle cellule trasformate: i cosiddetti “Hallmarks of Cancer”1. La metodologia qui descritta compila tre diversi strumenti per valutare la trasformazione cellulare in vitro concentrandosi su alcune delle caratteristiche distintive delle cellule tumorali. Queste tecniche valutano il tasso di proliferazione cellulare, il comportamento delle cellule quando coltivate in 3D e la loro capacità di formare colonie con indipendenza di ancoraggio.
I modelli cellulari sono fondamentali per testare l’ipotesi in vitro. Diversi approcci sono stati sviluppati per generare modelli sperimentali di trasformazione cellulare per lo studio del cancro2,3,4. Poiché il cancro al seno è il cancro più comune tra le donne in tutto il mondo ed è responsabile di circa il 15% dei decessi per cancrotra le donne 5, fornire modelli cellulari adatti di cellule epiteliali mammarie è della massima importanza per ulteriori indagini. In questo articolo, abbiamo illustrato il potenziale di tre tecniche per valutare la trasformazione cellulare utilizzando un modello sperimentale di trasformazione delle cellule epiteliali primarie del seno (BPEC) inizialmente descritto da Ince e colleghi nel 20076 e successivamente implementato nel nostro laboratorio7. Questo modello sperimentale si basa sull’alterazione sequenziale di tre geni mirati (SV40 Large T e piccoli antigeni t qui indicati come Ttag, hTERTe HRAS) al genoma dei BPEC non trasformati. Inoltre, il metodo utilizzato per la derivazione dei BPEC favorisce il mantenimento di cellule epiteliali mammarie con marcatori luminali o mioepiteliali, risultando in una coltura cellulare eterogenea che conserva alcuni dei tratti fisiologici della ghiandola mammaria.
Nella ghiandola mammaria, le cellule epiteliali mammarie luminali, che sono responsabili della produzione di latte, si trovano vicino al lume, mentre le cellule mioepiteliali vengono smaltite intorno alle cellule luminarie e si prendono cura dei movimenti di contrazione che portano il latte al capezzolo. La perdita di una corretta organizzazione tra questi lignaggi cellulari è una caratteristica dellatrasformazione tumorale 8 che può essere valutata in vitro dopo il rilevamento immunofluorescente di marcatori di lignaggio distintivi nelle colture cellulari 3D. Un’altra caratteristica importante delle cellule tumorali è la loro capacità di crescere senza attaccamento ad altre cellule e alla matrice extracellulare1. Quando le cellule sane sono costrette a crescere in sospensione, meccanismi come anoikis \u2012 un tipo di morte cellulare indotta in risposta al distacco dalla matrice extracellulare \u2012vengono attivati 9. L’evasione della morte cellulare è uno dei tratti distintivi del cancro e quindi, le cellule trasformate sono in grado di inattivare l’anoikis e sopravvivere in modo indipendente dall’ancora. Questa capacità può essere valutata in vitro con il saggio indipendente dall’ancoraggio utilizzando l’agar morbido. Inoltre, una caratteristica intrinseca dei tessuti tumorali è la loro capacità di segnalazione proliferativa sostenuta, che può essere facilmente monitorata in condizioni in vitro misurando l’aumento del numero di cellule nel tempo, non solo nei test di sospensione ma anche monitorando il tasso di crescita delle colture aderenti monostrato.
Nonostante il miglior modello per testare il potenziale tumorigenico sia l’inoculazione delle cellule tumorali nei modelli murini e la valutazione dello sviluppo tumorale in situ, è importante ridurre al minimo il più possibile il numero di animali impiegati nelle procedure sperimentali. Pertanto, avere test adeguati per valutare la trasformazione in vitro è una priorità assoluta. Qui, forniamo una serie di strumenti per valutare il potenziale tumorigenico delle cellule epiteliali del seno parzialmente e completamente trasformate che possono essere facilmente implementate nella maggior parte dei laboratori che lavorano con modelli di trasformazione cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli sperimentali descritti in questo documento forniscono strumenti utili per valutare la trasformazione oncogenica delle cellule coltivate in vitro. Ogni tecnica valuta aspetti specifici del processo di trasformazione e, pertanto, occorre prestare particolare attenzione quando si vengono tratte conclusioni da una singola analisi. L’accumulo di curve di crescita è un approccio che richiede informazioni già disponibili quando si coltivano cellule per altri scopi. Ciò rende questa tecnica più economica e più …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il laboratorio AG è finanziato dal Consiglio spagnolo per la sicurezza nucleare. T.A. e A.G. sono membri di un gruppo di ricerca riconosciuto dalla Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT ha un contratto finanziato dalla Fondazione Scientifica Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. Il contratto G.F. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione Cellex.
Materials
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 – 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
References
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