Un modello ortotopico di topo resezionale del cancro al pancreas
Summary
Nel contesto clinico, i pazienti con cancro al pancreas localizzato saranno sottoposti a pancreatectomia seguita da un trattamento adiuvante. Questo protocollo qui riportato mira a stabilire un metodo sicuro ed efficace per modellare questo scenario clinico nei topi nudi, attraverso l’impianto ortotopico del cancro al pancreas seguito da pancreatectomia distale e splenectomia.
Abstract
Mancano modelli animali soddisfacenti per studiare la terapia adiuvante e/o neoadiuvante nei pazienti presi in considerazione per la chirurgia del cancro al pancreas (PC). Per affrontare questa carenza, descriviamo un modello di topo che prevede l’impianto ortotopico del PC seguito da pancreatectomia distale e splenectomia. Il modello ha dimostrato di essere sicuro e adeguatamente flessibile per lo studio di vari approcci terapeutici in contesti adiuvanti e neoadiuvanti.
In questo modello, un tumore al pancreas viene generato per la prima volta impiantando una miscela di cellule tumorali pancreatiche umane (AsPC-1 taggate con luciferasi) e cellule stellate pancreatiche associate al cancro umano nel pancreas distale dei topi nudi atimici Balb / c. Dopo tre settimane, il cancro viene reinsediato da re-laparotomia, pancreatectomia distale e splenectomia. In questo modello, l’imaging a bioluminescenza può essere utilizzato per seguire i progressi dello sviluppo del cancro e gli effetti della resezione / trattamenti. Dopo la resezione, può essere somministrata una terapia adiuvante. In alternativa, il trattamento neoadiuvante può essere somministrato prima della resezione.
Vengono presentati i dati rappresentativi di 45 topi. Tutti i topi hanno subito una pancreatectomia/splenectomia distale di successo senza problemi di emostasi. Un margine pancreatico prossimale macroscopico superiore a 5 mm è stato raggiunto in 43 (96%) topi. Il tasso di successo tecnico della resezione pancreatica è stato del 100%, con una mortalità precoce e una morbilità dello 0%. Nessuno degli animali è morto durante la settimana successiva alla resezione.
In sintesi, descriviamo una tecnica robusta e riproducibile per un modello di resezione chirurgica del cancro al pancreas nei topi che imita lo scenario clinico. Il modello può essere utile per il test di trattamenti sia adiuvanti che neoadiuvanti.
Introduction
L’adenocarcinoma duttale pancreatico (tumore al pancreas [PC]) è associato a una prognosi infausta1. La resezione chirurgica rimane l’unico trattamento potenzialmente curativo per PC e deve essere presa in considerazione per i pazienti che presentano una malattia in fase iniziale. Sfortunatamente, anche con la resezione R0 (cioè margini di resezione liberi da tumore), il tasso di recidiva (locale o da malattia metastatica non rilevata) èalto 2,3. Pertanto, la terapia adiuvante sistemica è indicata in quasi tutti i pazienti sottoposti a resezione4. Inoltre, mentre la terapia neoadiuvante è ora raccomandata solo per i tumori resectabili al limite, le sue indicazioni si stanno espandendo in modo tale che il suo uso di routine sia al centro di moltericerche cliniche 5,6,7,8. Al fine di sviluppare nuovi approcci terapeutici per PC che coinvolgono la resezione, questi approcci devono essere prima valutati in modelli preclitici che riascindono accuratamente le impostazioni cliniche.
I modelli di mouse ortotopici di PC sono stati frequentemente utilizzati in passato per testare i trattamentifarmacologici 9,10. Molti di questi sono stati prodotti per iniezione di cellule tumorali da sole nel pancreas del topo, con conseguente tumori che mancavano dell’importante stroma che è caratteristico del PC. Più recentemente, i modelli ortotopici a co-iniezione, come quello che abbiamo sviluppato per la prima volta iniettando una miscela di PC umano e cellule stellate pancreatiche umane (PSC, i produttori primari dello stroma collagenoso nel PC), sono venuti in usoregolare 11,12. I tumori prodotti da tale co-iniezione di cancro e cellule stromali mostrano (i) sia gli elementi tumorali che la componente stromale caratteristica (desmoplastica) del PC, e (ii) maggiore proliferazione e metastasi delle cellule tumorali11. Pertanto, questo modello assomiglia molto al PC umano. Mentre un certo numero di modelli resezionali di PC ortotopico sono statidescritti 13,14,15,16, nessuno ha riflesso le realtà cliniche della resezione pancreatica nell’uomo accurato come questo modello, e quindi sono stati non ottimale per testare trattamenti adiuvanti o neoadiuvanti.
Gli obiettivi del modello di topo presentato erano di dimostrare come: i) impiantare con successo il cancro al pancreas ortotopico riducendo al minimo la diffusione peritoneale involontaria e (ii) successivamente resect completamente il cancro. Il documento evidenzia suggerimenti e potenziali insidie di questa tecnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un modello di topo ortotopico resezionale del cancro al pancreas è importante perché consente il test dei trattamenti adiuvanti e neoadiuvanti. Ciò è particolarmente importante nel cancro al pancreas, dove la chirurgia rimane il trattamento più efficace ma è associata ad un alto rischio di recidiva. Questo documento descrive un metodo che produrrà in modo affidabile un cancro al pancreas potenzialmente curabile con resezione, replicando lo scenario clinico in cui è richiesta una terapia neoadiuvante / adiuvante.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori hanno ricevuto il sostegno della Avner Pancreatic Cancer Foundation.
Materials
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
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