En minimal invasiv metode for intratrakeal instillasjon av legemidler hos neonatale gnagere for å behandle lungesykdom

Summary

Denne teknikken for å innpode legemidler direkte inn i luftrøret til nyfødte gnagere er viktig for å studere virkningen av lokalt administrerte legemidler eller biologiske stoffer på nyfødte lungesykdommer. I tillegg kan denne metoden også brukes til å indusere lungeskade i dyremodeller.

Abstract

Behandling av neonatal gnager med legemidler innpodet direkte i luftrøret kan tjene som et verdifullt verktøy for å studere virkningen av et lokalt administrert stoff. Dette har direkte translasjonspåvirkning fordi overflateaktivt middel og legemidler administreres lokalt i lungene. Selv om litteraturen har mange publikasjoner som beskriver minimalt invasiv transoral intubasjon av voksne mus og rotter i terapeutiske eksperimenter, mangler denne tilnærmingen i neonatale rottepupper. Den lille størrelsen på orotracheal region / svelget i valpene gjør visualisering av laryngeal lumen (stemmebånd) vanskelig, noe som bidrar til variabel suksessrate for intratrakeal legemiddellevering. Vi demonstrerer herved effektiv oral intubasjon av neonatal rottepupp – en teknikk som er ikke-traumatisk og minimalt invasiv, slik at den kan brukes til seriell administrering av legemidler. Vi brukte et operativt otoskop med belysningssystem og forstørrelseslinse for å visualisere trakealåpningen til rotte neonatene. Legemidlet innsettes deretter ved hjelp av en 1 ml sprøyte koblet til en pipettespiss. Nøyaktigheten av leveringsmetoden ble demonstrert ved hjelp av Evans blue dye administration. Denne metoden er lett å bli trent i og kan tjene som en effektiv måte å innpode narkotika i luftrør. Denne metoden kan også brukes til administrering av inokulum eller midler for å simulere sykdomstilstander hos dyr og også for cellebaserte behandlingsstrategier for ulike lungesykdommer.

Introduction

Nyfødte født for tidlig har dårlig utviklede lunger som krever mange intervensjonsterapier som langvarig ventilasjon. Disse intervensjonene setter de overlevende nyfødte med høy risiko for påfølgende oppfølger¹. Eksperimentelle dyremodeller fungerer som et viktig verktøy for å simulere ulike sykdomstilstander, studere sykdommenes patobiologi og evaluere terapeutiske inngrep. Selv om et bredt spekter av dyremodeller fra mus, rotte og kanin til pre-term lam og griser er tilgjengelige, er mus og rotte de mest brukte.

Den viktigste fordelen med å bruke mus og rotter er den relativt korte svangerskapsperioden og reduserte kostnader. De er også lett tilgjengelige, enkle å vedlikeholde i sykdomsfrie miljøer, genetisk homogene og har relativt mindre etisk bekymring ^2,3. En annen stor fordel med gnagermodellen er at neonatalpuppen ved fødselen er på sen canalicular / tidlig saccular stadium av lungeutvikling som er morfologisk tilsvarende lungen til et 24-ukers preterm neonatalt humant spedbarn som fortsetter å utvikle bronkopulmonal dysplasi⁴. I tillegg, etter hvert som lungeutviklingen utvikler seg raskt til ferdigstillelse i løpet av de første 4 ukene av livet, er det mulig å studere postnatal lungemodning i en rimelig tidsramme⁴. Til tross for disse fordelene er den lille størrelsen på musene og rottevalpene en kilde til bekymring for ulike intervensjoner, noe som tvinger de fleste forskere til å bruke voksne dyr i stedet for valper⁵. Neonatale lunger er i et utviklingsstadium, og responsen til en neonat til et oppfordringsmiddel er forskjellig fra en voksen. Dette gjør det hensiktsmessig å bruke nyfødte dyremodeller for å studere menneskelige neonatale sykdomstilstander.

Det finnes ulike metoder for å administrere legemidler/biologiske agenser til lungen. Dette inkluderer intranasal ^6,7 eller intratrakeal ^8,9,10 instillasjon samt aerosolinnånding^11,12. Hver tilnærming har sine egne tekniske utfordringer, fordeler, samt begrensninger¹³. Intratrakeal administreringsvei for terapeutiske midler er å foretrekke å studere den direkte terapeutiske effekten i orgelet som omgår de systemiske effektene. Denne ruten kan også brukes til å studere lungepatologi forårsaket av oppfordringsmidler. Det er både invasive og minimalt invasive teknikker for å gjøre dette og er lett å utføre hos voksne. Men i valper, på grunn av dyrets lille størrelse, er det tekniske utfordringer knyttet til intubasjonsprosessen. Den nåværende studien presenterer en enkel, konsistent, ikke-kirurgisk intratrakeal instillasjonsmetode (ITI) i rottepupper som kan brukes til å studere effekten av ulike neonatale terapeutiske intervensjoner, samt å generere dyremodeller som simulerer neonatale luftveissykdommer.

Protocol

Alle eksperimenter ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll # 2020-0035) ved Case Western Reserve University. Alle dyr ble behandlet i henhold til NIH-retningslinjene for pleie og bruk av forsøksdyr. 1. Dyr Kommersielt få gravide Sprague Dawley rotter. Vedlikehold dyr på et godkjent veterinæranlegg med 14 t/10 t lys-mørk syklus og 45-60% relativ fuktighet. 2. Forberedelse av testforbindelse Bruk …

Representative Results

Instillasjonen av Evans blå avslørte multifokal fordeling av fargestoffet som involverer alle lungelober (figur 4A,B). Vårt resultat som vist i figur 4 viser effekt av distribusjon til alle lober. Bildet er tatt umiddelbart etter ITI av fargestoffet i luftrøret. 100% effekt ble oppnådd ved å innpode fargestoffet i luftrøret etterfulgt av spredning til alle lober på begge sider. Det forventes at fargestoffet vil spre seg videre innenfor l…

Discussion

Intratrakeal instillasjon er en utmerket metode som gir flere fordeler i forhold til eksisterende metoder for respiratoriske sykdomsintervensjoner samt sykdomsmodellutvikling. Det er en rask metode og med erfaring kan utføres med en gjennomsnittlig hastighet på 2-3 minutter per dyr. De viktigste hensynene for en vellykket intubasjon er riktig sedasjon av dyret, det er riktig posisjonering, spesielt hodet, samt nøyaktig dybde av plassering / størrelse på spekula i oropharynx. Riktig sedasjon vil tillate tilstrekkelig…

Materials

Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	314-13-6	Confirmation of drug administration into lungs
Ketamine Hydrochloride	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA	Dispensed from Animal care facility	For sedation
Operating Otoscope	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	21770- 3.5V	For visualization of vocal cords
Otoscope Rechargeable Handle	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	71050-C
Pipette tip (Gel loading)	Fisherbrand	02-707-139	Administering the drug
Platform for restraining (inclined plane)	Animal care facility	Dispensed from Animal care facility	Wired roof of mice cage can be used
3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape)	3M, St. Paul, MN, USA	1530-2
Luer Lock SyringeSyringes (1 ml)	BD Franklin Lakes, NJ , USA	NBD2515	Administering the drug
Xylazine	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA		For sedation