En minimalt invasiv metod för intratrakeal instillation av läkemedel hos neonatala gnagare för behandling av lungsjukdom

Summary

Denna teknik för att införa läkemedel direkt i luftstrupen hos neonatala gnagare är viktig för att studera effekterna av lokalt administrerade läkemedel eller biologiska läkemedel på neonatala lungsjukdomar. Dessutom kan denna metod också användas för att inducera lungskada i djurmodeller.

Abstract

Behandling av neonatal gnagare med läkemedel som införs direkt i luftstrupen kan fungera som ett värdefullt verktyg för att studera effekterna av ett lokalt administrerat läkemedel. Detta har direkt translationell inverkan eftersom ytaktivt medel och läkemedel administreras lokalt i lungorna. Även om litteraturen har många publikationer som beskriver minimalt invasiv transoral intubation av vuxna möss och råttor i terapeutiska experiment, saknas detta tillvägagångssätt hos neonatala råttvalpar. Den lilla storleken på orotrakeal region / svalg i valparna gör visualisering av larynxlumen (stämband) svår, vilket bidrar till den varierande framgångsgraden för intratrakeal läkemedelsleverans. Vi demonstrerar härmed effektiv oral intubation av neonatal råttvalp – en teknik som är icke-traumatisk och minimalt invasiv, så att den kan användas för seriell administrering av läkemedel. Vi använde ett operativt otoskop med ett belysningssystem och en förstoringslins för att visualisera trakealöppningen hos de nyfödda råttorna. Läkemedlet införs sedan med en 1 ml spruta ansluten till en pipettspets. Noggrannheten i leveransmetoden demonstrerades med hjälp av Evans blå färgämnesadministration. Denna metod är lätt att utbilda sig i och kan fungera som ett effektivt sätt att införa droger i luftstrupen. Denna metod kan också användas för administrering av inokulum eller medel för att simulera sjukdomstillstånd hos djur och även för cellbaserade behandlingsstrategier för olika lungsjukdomar.

Introduction

Nyfödda födda för tidigt har dåligt utvecklade lungor som kräver många interventionella terapier som långvarig ventilation. Dessa ingrepp placerar de överlevande nyfödda i en hög risk för efterföljande följdsjukdomar¹. Experimentella djurmodeller fungerar som ett viktigt verktyg för att simulera olika sjukdomstillstånd, studera sjukdomarnas patobiologi och utvärdera terapeutiska ingrepp. Även om ett brett utbud av djurmodeller från möss, råtta och kanin till förtida lamm och grisar finns tillgängliga, är möss och råtta de mest använda.

Den främsta fördelen med att använda möss och råttor är den relativt korta graviditetsperioden och minskade kostnader. De är också lättillgängliga, lätta att underhålla i sjukdomsfria miljöer, genetiskt homogena och har relativt mindre etisk oro ^2,3. En annan stor fördel med gnagarmodellen är att den neonatala valpen vid födseln befinner sig i ett sent kanaliskt /tidigt sakkulärt stadium av lungutveckling som är morfologiskt ekvivalent med lungan hos ett 24-veckors för tidigt neonatalt mänskligt spädbarn som fortsätter att utveckla bronkopulmonell dysplasi⁴. Dessutom, eftersom deras lungutveckling snabbt fortskrider till fullbordan inom de första 4 veckorna av livet, är det möjligt att studera den postnatala lungmognaden inom en rimlig tidsram⁴. Trots dessa fördelar är den lilla storleken på möss och råttvalpar en källa till oro för olika ingrepp, vilket tvingar de flesta forskare att använda vuxna djur snarare än valpar⁵. Neonatala lungor befinner sig i ett utvecklingsstadium och svaret från en nyfödd på ett uppviglande medel skiljer sig från en vuxens. Detta gör det lämpligt att använda neonatala djurmodeller för att studera mänskliga neonatala sjukdomstillstånd.

Det finns olika metoder för att administrera läkemedel/biologiska agenser till lungan. Detta inkluderar intranasal ^6,7 eller intratrakeal ^8,9,10 instillation samt aerosolinandning^11,12. Varje tillvägagångssätt har sina egna tekniska utmaningar, fördelar och begränsningar¹³. Intratrakeal administreringsväg för terapeutiska medel föredras för att studera den direkta terapeutiska effekten i organet som kringgår de systemiska effekterna. Denna väg kan också användas för att studera lungpatologi orsakad av uppviglande medel. Det finns både invasiva och minimalt invasiva tekniker för att göra detta och är lätt att utföra hos vuxna. Men hos valpar, på grund av djurets lilla storlek, finns det tekniska utmaningar i samband med intubationsprocessen. Den aktuella studien presenterar en enkel, konsekvent, icke-kirurgisk intratrakeal instillation (ITI) -metod hos råttvalpar som kan användas för att studera effekten av olika neonatala terapeutiska ingrepp samt för att generera djurmodeller som simulerar neonatala andningssjukdomar.

Protocol

Alla experiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll # 2020-0035) vid Case Western Reserve University. Alla djur behandlades i enlighet med NIH:s riktlinjer för vård och användning av försöksdjur. 1. Djur Kommersiellt få gravida Sprague Dawley råttor. Håll djur på en godkänd veterinäranläggning med 14 h/10 h ljus-mörk cykel och 45-60% relativ luftfuktighet. 2. Beredning av testförening <li…

Representative Results

Instillationen av Evans blå avslöjade multifokal fördelning av färgämnet som involverade alla lunglober (figur 4A,B). Vårt resultat som visas i figur 4 visar effekten av distributionen till alla lober. Bilden tas omedelbart efter ITI av färgämnet i luftstrupen. 100% effekt uppnåddes vid ingjutning av färgämnet i luftstrupen följt av dess spridning i alla lober på båda sidor. Det förväntas att färgämnet skulle spridas vidare ino…

Discussion

Intratrakeal instillation är en utmärkt metod som erbjuder flera fördelar jämfört med befintliga metoder för respiratoriska sjukdomsinterventioner samt utveckling av sjukdomsmodeller. Det är en snabb metod och med erfarenhet kan utföras med en genomsnittlig hastighet på 2-3 minuter per djur. De viktigaste övervägandena för en lyckad intubation är korrekt sedering av djuret, det är korrekt positionering, särskilt huvudet, samt exakt djup av placering / storlek på spekulan i orofarynxen. Korrekt sedering sk…

Materials

Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	314-13-6	Confirmation of drug administration into lungs
Ketamine Hydrochloride	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA	Dispensed from Animal care facility	For sedation
Operating Otoscope	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	21770- 3.5V	For visualization of vocal cords
Otoscope Rechargeable Handle	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	71050-C
Pipette tip (Gel loading)	Fisherbrand	02-707-139	Administering the drug
Platform for restraining (inclined plane)	Animal care facility	Dispensed from Animal care facility	Wired roof of mice cage can be used
3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape)	3M, St. Paul, MN, USA	1530-2
Luer Lock SyringeSyringes (1 ml)	BD Franklin Lakes, NJ , USA	NBD2515	Administering the drug
Xylazine	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA		For sedation