Den her beskrevne protokol har til formål at måle den hydrodynamiske diameter af sfæriske nanopartikler, mere specifikt guld nanopartikler, i vandige medier ved hjælp af Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Sidstnævnte indebærer sporing af bevægelsen af partikler på grund af Brownian bevægelse og gennemføre Stokes-Einstein ligning for at opnå den hydrodynamiske diameter.
Inden for nanoteknologi spiller analytisk karakterisering en afgørende rolle i forståelsen af nanomaterialers (NMs) adfærd og toksicitet. Karakterisering skal være grundig, og den valgte teknik skal være velegnet til den egenskab, der skal bestemmes, det materiale, der analyseres, og det medium, hvor det er til stede. Desuden skal instrumentets funktion og metode være veludviklet og klart forstået af brugeren for at undgå dataindsamlingsfejl. Eventuelle uoverensstemmelser i den anvendte metode eller procedure kan føre til forskelle og dårlig reproducerbarhed af de opnåede data. Dette papir har til formål at præcisere metoden til måling af den hydrodynamiske diameter af guld nanopartikler ved hjælp af Nanopartikel Tracking Analysis (NTA). Denne undersøgelse blev udført som en sammenligning mellem laboratorier (ILC) mellem syv forskellige laboratorier for at validere standardprocedurens ydeevne og reproducerbarhed. Resultaterne af denne ILC-undersøgelse afslører vigtigheden og fordelene ved detaljerede standardprocedurer, opdateringer af bedste praksis, brugerkendskab og målingsautomatisering.
Nanomaterialer (NMs) kan variere i både fysiske og kemiske egenskaber, der igen påvirker deres adfærd, stabilitet ogtoksicitet 1,2,3,4,5. En af de største vanskeligheder, når man udvikler en grundig forståelse af NM-egenskaber, farer og adfærd, er evnen til at opnå reproducerbare oplysninger om fysiske og kemiske nanomaterialer. Eksempler på sådanne fysiske egenskaber omfatter partikelstørrelse og størrelsesfordeling6,7,8. Det er vigtige parametre, da de er et centralt aspekt af Europa-Kommissionens (EF) definition af begrebet “nano”9.
Opnåelse af præcise partikelstørrelsesmålinger er også afgørende for mange forskellige industrielle og forskningsmæssige anvendelser og processer ud over at forstå skæbnen og toksicitetseffekterne af NMs6,10. Det er vigtigt at have veletablerede metoder, der er i stand til at måle nøjagtigt, pålideligt og reproducerbart størrelsen af NMs. Desuden bør de indberettede oplysninger give en dyb forståelse af den anvendte teknik, f.eks. For at måle størrelsen kan der anvendes en række teknikker, herunder elektronmikroskopi (EM), dynamisk lysspredning (DLS), enkeltpartikelinduktivt koblet plasmamassespektrometri (spICP-MS), differential centrifugal sedimentering (DCS), scanning af sondemikroskopi (SPM), lillevinkel røntgenspredning (SAXS) og nanopartikelsporingsanalyse (NTA).
NTA er en relativt ny teknologi, som har været langt fremme i de senere år, og som har vist sig at måle den hydrodynamiske diameter af sfæriske NMs pålideligt i komplekse vandige medier som f.eks. Den hydrodynamiske diameter er »størrelsen af en hypotetisk hård kugle, der diffunderer på samme måde som den partikel, der måles«11; i praksis og i vandige medier beskriver dette en diameter, der er større end selve partikelens, som også omfatter et lag af molekyler (for det meste vand), der holdes på overfladen af partikel af svage elektrostatiske kræfter. Den hydrodynamiske diameter af en partikel vil variere i forskellige medier, bliver mindre som den ioniske styrke af de medier, hvor det måles bliver højere.
Et yderligere vigtigt træk ved NTA-teknikken er, at den gør det muligt for analytikeren at opnå talvægtede størrelsesmålinger, som er nødvendige i forbindelse med EF’s nanomaterialedefinition. Høj opløsning, partikel-for-partikel analyse gør denne teknik mindre tilbøjelige til interferens forårsaget af agglomerater eller større partikler, når de findes i en heterogen testprøve med en høj partikel gennemløb10,12.
Måleproceduren består i at forberede en passende suspension af prøven, som ofte kræver prøvefortynding, efterfulgt af videooptagelse af partiklernes Brownian-bevægelsesadfærd og videoanalyse. Fra prøvekammeret passeres en laserstråle, og suspensionspartiklerne i laserstrålens sti spreder lys, der fører til deres visualisering ved hjælp af et optisk mikroskop med et monteret kamera. Kameraet optager en videofil af det spredte laserlys fra partiklerne, der bevæger sig under Brownian-bevægelse. Mange partikler kan spores individuelt for at bestemme deres diffusionskoefficienter, og deres hydrodynamiske diametre kan beregnes ved hjælp af Stokes-Einstein-ligningen: d = kT/3πηD, hvor d er den hydrodynamiske diameter, k er Boltzmann-konstanten, T er temperaturen, η er viskositeten, og D er diffusionskoefficienten10. NTA kan også bruges til at spore aggregeringsadfærden af partikler, der generelt er kolloidt ustabile (partiklerne skal dog være kolloidt stabile over måletidsskalaen)13,14. NTA er en absolut metode, og der kræves ingen systemkalibrering på det instrument, der anvendes i dette arbejde. Hvis brugerne ønsker at kontrollere systemets ydeevne dette kan nemt gøres ved at måle størrelse standard materialer så ofte som ønsket.
NTA-instrumentet er let at betjene med hurtig analysetid (under 10 min pr. prøve). Ved målinger af høj kvalitet med god datagennemelighed og reproducerbarhed bør en række faktorer tages i betragtning både i prøveforberedelsen og i instrumentdriften. Hvis sådanne faktorer ikke overvejes nøje, kan målinger af det samme materiale på tværs af forskellige laboratorier og operatører blive udsat for ukendte eller dårligt kvantificerede usikkerheder. Under NP karakterisering, ved hjælp af bedste praksis in-house udviklede SOP’er ikke altid garantere overensstemmelse med andre laboratorier, som det fremgår af Roebben et al. for DLS teknik15.
Faktisk afslørede en tidlig (første runde) NTA ILC mellem forskellige laboratorier, brugere og instrumenter inkonsekvente resultater. Et af hovedproblemerne var brugen af forskellige ældre ældre ældre instrumenter, som ikke havde haft regelmæssig service eller kalibreringskontrol, samt forskelle i metodefortolkning. En NTA ILC-undersøgelse foretaget af Hole et al. viste, at med manglen på fælles retningslinjer for, hvordan man bruger et system og forbereder prøver, kan variationen på tværs af laboratorier være stor, selv for relativt monodisperserede prøver16. Dette sammen med resultaterne fra første runde af ILC understreger behovet for god instrumentvedligeholdelse samt metodetræning og veludviklede standardprocedurer. Sidstnævnte fungerer som et effektivt redskab til at beskrive og dokumentere overholdelse af god praksis. Hvis det er godt detaljeret, kan standardprocedurer tilbyde klarhed, forklaring, forståelse, standardisering og kvalitetssikring.
Anbefalingen om at vedtage en ILC-undersøgelse er derfor ideel til både udvikling og afprøvning af protokoller16. ILC-øvelsen handlede for at validere denne specifikke NTA-SOP og indførte derfor tillid og klarhed i denne specifikke nanomaterialerisikovurderingsmetode. Det involverede tre runder. Runde 1 analyserede 60 nm guld nanopartikler på hver deltagers egne instrumenter før træning. Runde 2 involverede analyse af 100 nm latex ved hjælp af et nyt instrument med fælles konfiguration som en simpel test for at fastslå, at instrumentet blev oprettet korrekt, og brugerne havde et godt kendskab til, hvordan instrumentet skulle bruges. Runde 3 omfattede analyse af 60 nm guld nanopartikler på det nye instrument med fælles konfiguration, efter træning. Deltagerne i ILC kom fra syv forskellige laboratorier, alle konsortiemedlemmer af Horizon 2020 ACEnano-projektet17.
Formålet med denne artikel er at diskutere metoden og resultaterne fra en tredje runde af benchmarking for NTA-teknologi, hvor 60 nm guld NPs blev re-analyseret af syv partnere efter detaljeret uddannelse og SOP udvikling. Der vil også blive foretaget en sammenligning og henvisning til de resultater, der er opnået i første runde af ILC. Alle analyser fra runde 3 af ILC blev udført ved hjælp af det samme instrument (se Materialetabel)af identisk konfiguration leveret med en 405 nm laser og et højfølsomt SCMOS-kamera. Benchmarking vurderer teknologiens ydeevne på stikprøver og fører derfor til udvikling af protokoller om bedste praksis. Denne artikel deler og gør således også NTA-metoden for det instrument, der anvendes i denne ILC, tilgængelig for det videnskabelige samfund, da den er blevet harmoniseret ved at gennemføre og evaluere ILC’erne i overensstemmelse med internationale standarder.
De inkonsekvente resultater fra runde 1 ILC fremhævede behovet for instrumentsundhedskontrol for ældre systemer samt udviklingen af en mere detaljeret SOP, behovet for praktisk træning og en bedre forståelse af måle- og analyseindstillinger for at sikre mere ensartede resultater på tværs af de forskellige laboratorier. Faktisk fandt Hole et al., at manglen på fælles retningslinjer for, hvordan man bruger et NTA-system og forbereder prøver, resulterede i variabilitet på tværs af laboratorier selv for relativt monoperserede prøver16. Derfor deltog alle ILC-deltagere i en træningsworkshop, der dækkede de bedste praksis for systemets drifts- og måleforhold samt rengørings- og vedligeholdelsesvejledning til det specifikke NTA-instrument. Alle deltagere udførte også målinger på det samme instrument i deres egne laboratorier til de efterfølgende ILC-runder. Proceduren involverede først en runde, der testede systemet lokalt i hvert laboratorium ved at køre en ILC på latex standardprøver (ILC Runde 2), før den blev brugt af partnerne til at gentage guldmålingerne (ILC Runde 3). Formålet med at måle disse guldprøver ved hjælp af NTA var at skabe tillid og klarhed i nanomateriale risikovurderingsmetoder og -praksis, der er nødvendige for at påvirke nanosikkerhedsvejledningsprotokoller.
NTA er en teknik, der kan måle partiklernes hydrodynamiske sfæriske tilsvarende diameter og kan bruges til partikel ved partikel, realtids visuel analyse af polydisperserede systemer fra 10 nm – 50 nm til ca. 1000 nm i størrelse (afhængigt af prøveegenskaberne og instrumentkonfigurationen). Minimal prøveforberedelse er påkrævet. På trods af minimal prøveforberedelse er dette trin kritisk for protokollen, og der skal udvises stor omhu ved fortynding af en prøve og valg af fortyndingsmiddel. Form kan være en begrænsende faktor med hensyn til NTA, da der opnås sfæriske målinger af tilsvarende størrelse, og ikke-sfæriske partikler vil have en mindre nøjagtig størrelsesværdi.
For NTA-teknologi kan der altid forventes en vis resultatvariation, da der kun observeres en repræsentativ stikprøve fra hele prøven. Uanset hvad opfylder alle resultater ISO 19430-standarden for partikelstørrelse. Den optimale koncentration, der skal leveres, er typisk omkring10 8 partikler/ml inden for en analysetid på 30-60 sekunder. For prøver med lavere partikelkoncentrationer kræves der længere analysetider for at sikre reproducerbare resultater. For prøver, der indeholder en koncentration af partikler på over 109 partikler/mL, er der større sandsynlighed for sporingsproblemer, og prøverne skal fortyndes ned til et passende område til NTA-måling.
Samlet set viser resultaterne fra 3rd Round ILC god reproducerbarhed af guld nanopartikelmålinger med NTA med øget nøjagtighed og repeterbarhed. Alle NTA-målinger blev udført ved hjælp af de automatiske kameraniveau- og fokusindstillinger for at justere billedet, som valgt af funktionen Automatisk konfiguration i softwaren. Kameraniveauet, der er indstillet af softwaren, var meget konsistent, idet et kameraniveau på 10 eller 11 blev indstillet i alle tilfælde, hvilket viser, at jo mere automatisering en proces inkluderer, jo mere konsistens opnås. Størrelsesresultaterne var sammenlignelige med dem, som fabrikanten opnåede ved hjælp af TEM, hvilket tyder på, at resultaterne kunne reproduceres, men der kan forventes minimale forskelle fra forskellige teknikker, da TEM ikke bestemmer hydrodynamisk diameter. Den betydelige forbedring af resultaternes konsistens viser vigtigheden og fordelene ved instrumentvedligeholdelse, detaljerede programprogrammer, opdateringer af bedste praksis, brugerkendskab og anvendt måleautomatisering for NTA. Afslutningsvis godkendte ILC denne specifikke NTA-SOP og indførte derfor tillid og klarhed i denne specifikke nanomaterialerisikovurderingsmetode.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender finansiel støtte fra H2020-finansieret projekt: ACEnano (tilskudsaftale nr. 720952). Dette arbejde blev også delvist støttet af Det Internationale Samarbejdsprogram for Forskning og Udvikling finansieret af Ministeriet for Handel, Industri og Energi i Korea (tilskudsnummer N053100009, “Horizon2020 Kor-EU collaborative R&BD on ACEnano Toolbox”), som muliggjorde deltagelse af de koreanske partnere i konsortiet af Horizon 2020 ACEnano Project.
60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |