Det protokoll som beskrivs här syftar till att mäta den hydrodynamiska diametern hos sfäriska nanopartiklar, närmare bestämt guldnanopartiklar, i vattenhaltiga medier med hjälp av Nanopartikelspårningsanalys (NTA). Det senare innebär att spåra partiklarnas rörelse på grund av brownsk rörelse och genomföra Stokes-Einstein-ekvationen för att få den hydrodynamiska diametern.
Inom nanotekniken spelar analytisk karakterisering en viktig roll för att förstå nanomaterialens beteende och toxicitet .In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). Karakteriseringen måste vara grundlig och den teknik som väljs bör vara väl lämpad för den egenskap som ska bestämmas, materialet analyseras och det medium där det finns. Dessutom måste instrumentets funktion och metodik vara välutvecklad och tydligt förstådd av användaren för att undvika datainsamlingsfel. Eventuella avvikelser i den tillämpade metoden eller förfarandet kan leda till skillnader och dålig reproducerbarhet av erhållna uppgifter. Detta dokument syftar till att klargöra metoden för att mäta den hydrodynamiska diametern hos guldnanopartiklar med hjälp av Nanopartikelspårningsanalys (NTA). Denna studie utfördes som en jämförelse mellan laboratorier (ILC) mellan sju olika laboratorier för att validera standardrutinernas prestanda och reproducerbarhet. Resultaten från denna ILC-studie visar vikten och fördelarna med detaljerade standardrutiner (SOPs), bästa praxisuppdateringar, användarkunskap och mätautomation.
Nanomaterial (NMs) kan variera i både fysiska och kemiska egenskaper som i sin tur påverkar deras beteende, stabilitet ochtoxicitet 1,2,3,4,5. En av de största svårigheterna, när man utvecklar en grundlig förståelse av NM-egenskaper, faror och beteenden, är förmågan att få reproducerbar information om fysiska och kemiska nanomaterialegenskaper. Exempel på sådana fysiska egenskaper är partikelstorlek ochstorleksfördelning 6,7,8. Detta är viktiga parametrar eftersom de är en nyckelaspekt i Europeiska kommissionens (EG) definition av termen nano9.
Att uppnå exakta partikelstorleksmätningar är också avgörande för många olika industriella och forskningsapplikationer och processer förutom att förstå ödet och toxicitetseffekterna av NMs6,10. Det är viktigt att ha väletablerade metoder som på ett korrekt, tillförlitligt och reproducerbart sätt kan mäta storleken på NMs. Dessutom bör rapporterad information ge en djup förståelse för den teknik som används, t.ex. ange typen av storleksparameter (t.ex. faktisk storlek eller hydrodynamisk storlek) samt provtillståndet, t.ex. För att mäta storlek kan ett antal tekniker användas, inklusive elektronmikroskopi (EM), dynamisk ljusspridning (DLS), enkelpartikel induktivt kopplade plasmamasspektrometri (spICP-MS), differentialcentrifugalsedimentering (DCS), scanningsondmikroskopi (SPM), småvinkelröntgenspridning (SAXS) och nanopartikelspårningsanalys (NTA).
NTA är en relativt ny teknik som har kommit långt under de senaste åren och som har visat sig på ett tillförlitligt sätt mäta den hydrodynamiska diametern hos sfäriska NMs i komplexa vattenhaltiga medier, t.ex. Den hydrodynamiska diametern är “storleken på en hypotetisk hård sfär som sprids på samma sätt som den partikel som mäts”11. i praktiken och i vattenhaltiga medier beskriver detta en diameter större än själva partikelns, som också innehåller ett lager av molekyler (mestadels vatten) som hålls vid partikelns yta av svaga elektrostatiska krafter. En partikels hydrodynamiska diameter varierar i olika medier och blir mindre när den joniska styrkan hos det medium där den mäts blir högre.
En annan viktig egenskap hos NTA-tekniken är att den gör det möjligt för analytikern att uppnå nummerviktade storleksmätningar, som krävs inom ramen för EG:s nanomaterialdefinition. Högupplöst, partikel-för-partikelanalys gör denna teknik mindre benägen för interferens orsakad av agglomerat eller större partiklar när den finns i ett heterogent testprov med en hög partikelgenomströmningshastighet10,12.
Mätförfarandet består i att förbereda en lämplig suspension av provet, vilket ofta kräver provutspädning, följt av videoinspelning av partiklarnas brownska rörelsebeteende och videoanalys. Från provkammaren passeras en laserstråle och upphängningspartiklarna i laserstrålens väg sprider ljus som leder till deras visualisering med hjälp av ett optiskt mikroskop med en monterad kamera. Kameran fångar en videofil av det spridda laserljuset från partiklarna som rör sig under brownsk rörelse. Många partiklar kan spåras individuellt för att bestämma deras diffusionskoefficienter och deras hydrodynamiska diametrar kan beräknas med hjälp av Stokes-Einstein-ekvationen: d = kT/3πηD där d är den hydrodynamiska diametern, k är Boltzmann-konstanten, T är temperaturen, η är viskositeten och D är diffusionskoefficienten10. NTA kan också användas för att spåra aggregeringsbeteendet hos partiklar som i allmänhet är kolloidally instabila (partiklarna måste dock vara kolloidiskt stabila över mättidsskalan)13,14. NTA är en absolut metod och ingen systemkalibrering krävs på det instrument som används i detta arbete. Om användare vill kontrollera systemets prestanda kan detta enkelt göras genom att mäta standardmaterial i storlek så ofta som önskas.
NTA-instrumentet är lätt att använda med snabb analystid (under 10 min per prov). För högkvalitativa mätningar med god datarepeterbarhet och reproducerbarhet bör ett antal faktorer beaktas i både provberedningen och instrumentdriften. Om sådana faktorer inte beaktas noggrant kan mätningar av samma material mellan olika laboratorier och operatörer bli föremål för okänd eller dåligt kvantifierad osäkerhet. Under NP karakterisering, med hjälp av bästa praxis internt utvecklade SOPs garanterar inte alltid överensstämmelse med andra laboratorier, som visas av Roebben et al. för DLS teknik15.
I själva verket visade en tidig (första omgången) NTA ILC mellan olika laboratorier, användare och instrument inkonsekventa resultat. En av de viktigaste frågorna var användningen av olika äldre äldre instrument som inte hade haft regelbundna trafik- eller kalibreringskontroller samt skillnader i metodtolkning. En NTA ILC-studie av Hole et al. fann att med avsaknaden av gemensamma riktlinjer för hur man använder ett system och förbereder prover kan variabiliteten mellan laboratorier vara stor även för relativt monodisperserade prover16. Detta tillsammans med resultaten från den första omgången av ILC belyser behovet av bra instrumentunderhåll samt metodutbildning och välutvecklade standardrutiner. Det senare fungerar som ett kraftfullt verktyg för att beskriva och dokumentera efterlevnaden av god praxis. Om det är väl detaljerat kan standardrutiner (SOPs) erbjuda tydlighet, förklaring, förståelse, standardisering och kvalitetssäkring.
Rekommendationen att anta en ILC-studie är därför idealisk för både utvecklings- och testprotokoll16. ILC agerade för att validera denna specifika NTA SOP och införde därför förtroende och tydlighet i denna specifika nanomaterial riskbedömningsmetod. Det var tre ronder. Omgång 1 analyserade 60 nm guldnanopartiklar på varje deltagares egna instrument före träning. Omgång 2 involverade analys av 100 nm latex med ett nytt instrument med gemensam konfiguration som ett enkelt test för att fastställa att instrumentet var korrekt konfigurerat och användarna hade god kunskap om hur man använder instrumentet. Omgång 3 omfattade analys av 60 nm guldnanopartiklar på det nya instrumentet med gemensam konfiguration, efter träning. Deltagarna i ILC kom från sju olika laboratorier, alla konsortiemedlemmar i Horizon 2020 ACEnano-projektet17.
Syftet med denna artikel är att diskutera metoden och resultaten från en tredje omgång benchmarking för NTA-tekniken där 60 nm guld-NPs analyserades på nytt av sju partners efter detaljerad utbildning och SOP-utveckling. Jämförelse och hänvisning till de resultat som erhållits i den första omgången av ILC kommer också att göras. Alla analyser från omgång 3 av ILC utfördes med samma instrument (se Materialförteckning)med identisk konfiguration som levererades med en 405 nm laser och en sCMOS-kamera med hög känslighet. Benchmarking bedömer teknikens prestanda på proverna och leder därmed till utvecklingen av protokoll för bästa praxis. Således delar och gör denna artikel också NTA-metoden för det instrument som används i detta ILC tillgänglig för forskarsamhället eftersom den har harmoniserats genom att genomföra och utvärdera IDC enligt internationella standarder.
De inkonsekventa resultaten från ILC i omgång 1 belyste behovet av instrumenthälsokontroller för äldre system samt utvecklingen av en mer detaljerad SOP, behovet av praktisk utbildning och en bättre förståelse för mät- och analysinställningar för att säkerställa mer konsekventa resultat i de olika laboratorierna. I själva verket fann Hole et al. att avsaknaden av gemensamma riktlinjer för hur man använder ett NTA-system och utarbetar prover resulterade i variabilitet mellan laboratorier även för relativt monodisperserade prover16. Därför deltog alla ILC-deltagare i en utbildningsworkshop som omfattade bästa praxis för systemets drifts- och mätförhållanden samt rengörings- och underhållsvägledning för det specifika NTA-instrumentet. Alla deltagare utförde också mätningar på samma instrument i sina egna labb för de efterföljande ILC-omgångarna. Förfarandet omfattade först en runda som testade systemet lokalt i varje laboratorium genom att köra ett ILC på latexstandardprover (ILC omgång 2), innan det användes av partnerna för att upprepa guldmätningarna (ILC omgång 3). Syftet med att mäta dessa guldprover genom NTA var att införa förtroende och tydlighet i de nanomaterial riskbedömningsmetoder och metoder som krävs för att påverka nanosäkerhetsprotokollen.
NTA är en teknik som kan mäta partiklarnas hydrodynamiska sfäriska ekvivalenter diameter och kan användas för partikel per partikel, visuell analys i realtid av polydisperserade system från 10 nm till cirka 1000 nm i storlek (beroende på provegenskaper och instrumentkonfiguration). Minimal provberedning krävs. Trots minimal provberedning är detta steg avgörande för protokollet och stor försiktighet bör vidtas när man späder ut ett prov och väljer ett spädning. Form kan vara en begränsande faktor när det gäller NTA eftersom sfäriska motsvarande storleksmätningar erhålls och icke-sfäriska partiklar kommer att ha ett mindre exakt storleksvärde.
För NTA-teknik kan viss resultatvariation alltid förväntas eftersom endast ett representativt prov observeras från hela provet. Oavsett uppfyller alla resultat ISO 19430-standarden för partikelstorlek. Den optimala koncentrationen att tillhandahålla är vanligtvis cirka10 8 partiklar/ml inom en 30-60 sekunders analystid. För prover med lägre partikelkoncentrationer krävs längre analystider för att säkerställa reproducerbara resultat. För prover som innehåller en koncentration av partiklar över 109 partiklar/ml är sannolikheten större för spårningsproblem och prover måste spädas ned till ett lämpligt intervall för NTA-mätning.
Sammantaget visar resultaten från 3rd Round ILC god reproducerbarhet av guldnanopartiklarmätningar med NTA med ökad noggrannhet och repeterbarhet. Alla NTA-mätningar utfördes med hjälp av den automatiska kameranivån och fokusinställningarna för att justera bilden, enligt vad som valts av funktionen Automatisk installation i programvaran. Kameranivån som ställts in av programvaran var mycket konsekvent, med en kameranivå på 10 eller 11 som i alla fall visar att som förväntat, desto mer automatisering innehåller en process desto mer konsekvens uppnås. Storleksresultaten var jämförbara med dem som tillverkaren erhållit genom TEM som visade att resultaten var reproducerbara, men minimala skillnader kan förväntas från olika tekniker eftersom TEM inte bestämmer hydrodynamisk diameter. Den betydande förbättringen av resultatens enhetlighet visar vikten och fördelarna med instrumentunderhåll, detaljerade sop, uppdateringar av bästa praxis, användarkunskap och tillämpad mätautomation för NTA. Sammanfattningsvis validerade ILC denna specifika NTA SOP och införde därför förtroende och tydlighet i denna specifika nanomaterialriskbedömningsmetod.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från H2020-finansierat projekt: ACEnano (Bidragsavtal nr 720952). Detta arbete stöddes också delvis av det internationella kooperativa FoU-programmet som finansierades av Koreas handels-, industri- och energiministerium (bidragsnummer N053100009, “Horizon2020 Kor-EU collaborative R&BD on ACEnano Toolbox”) som gjorde det möjligt för de koreanska partnerna att delta i konsortiet för Horizon 2020 ACEnano Project.
60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |