הזרקה תוך-ואטראלית וכמות של פרמטרי זיהום במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי
Summary
אנו מתארים כאן שיטה של הזרקה תוך-ואטראלית וכמות חיידקית עוקבת במודל העכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי. ניתן להאריך פרוטוקול זה למדידת תגובות חיסוניות מארחות וביטוי גנים חיידקי ומארח.
Abstract
זיהומים חיידקיים תוך עיניים מהווים סכנה לחזון. חוקרים משתמשים במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את הגורמים המארחים והחיידקיים ואת מסלולי התגובה החיסונית הקשורים לזיהום כדי לזהות מטרות טיפוליות קיימא ולבדוק תרופות למניעת עיוורון. טכניקת ההזרקה התוך-ויטריאלית משמשת להזרקת אורגניזמים, סמים או חומרים אחרים ישירות לחלל הירך בחלק האחורי של העין. כאן, הדגמנו טכניקת הזרקה זו כדי ליזום זיהום בעין העכבר ואת הטכניקה של כימות חיידקים תוך עיניים. Bacillus cereus גדל במדיה נוזלית עירוי לב המוח במשך 18 שעות ו resuspended לריכוז 100 מושבה להרכיב יחידות (CFU)/0.5 μL. עכבר C57BL/6J היה הרדמה באמצעות שילוב של קטמין וקסילאזין. באמצעות מיקרו-מיינר פיקוליטר ומחטי נימי זכוכית, הוזרק 0.5 מיקרו-ל’ של ההשעיה של בצילוס אל תוך זיבת האמצע של עין העכבר. עין הבקרה ההפוך הוזרקה עם מדיה סטרילית (שליטה כירורגית) או לא הוזרקה (שליטה מוחלטת). ב 10 שעות לאחר זיהום, עכברים היו המתת דם, ועיניים נקצרו באמצעות פינצטה כירורגית סטרילית והוכנסו לצינור המכיל PBS סטרילי μL 400 ו 1 מ”מ חטוזי זכוכית סטרילית. עבור ELISAs או מיאלופרוקסידאז, מעכב פרוטאינאז נוסף לצינורות. עבור חילוץ RNA, מאגר התיזה המתאים נוסף. העיניים היו הומוגניות ב homogenizer רקמות במשך 1-2 דקות. הומוג’נים דוללים באופן סדרתי פי 10 ב-PBS ומעקב מדולל על צלחות אגר. שאר ההומוגנים אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס לצורך בדיקות נוספות. צלחות היו דגירה במשך 24 שעות CFU לכל עין היה לכמת. טכניקות אלה לגרום זיהומים לשחזור בעיני העכבר להקל על כימות של חיידקים קיימא, התגובה החיסונית המארחת, ו omics של ביטוי גנים מארח חיידקי.
Introduction
אנדופתלמיטיס בקטריאלי הוא זיהום הרסני שגורם לדלקת, ואם לא מטופלים כראוי, יכול לגרום לאובדן ראייה או עיוורון. אנדופתלמיטיס נובעת כניסת חיידקים לתוך הפנים שלהעין 1,2,3,4,5. פעם אחת בעין, חיידקים לשכפל, לייצר רעלים וגורמים מזיקים אחרים, והוא יכול לגרום נזק בלתי הפיך לתאי רשתית עדינים ורקמות. נזק עיני יכול להיגרם גם על ידי דלקת, עקב הפעלת מסלולים דלקתיים המוביל זרם תאים דלקתיים לתוךהפנים של העין 1,5,6. אנדופתלמיטיס יכול להתרחש לאחר ניתוח תוך עיני (לאחר הניתוח), פציעה חודרת לעין (פוסט טראומטית), או מהתפשטות גרורתית של חיידקים לתוך העין מאתר אנטומי אחר (אנדוגני)7,8,9,10. הטיפולים בדלקת אנדופתלמית חיידקית כוללים אנטיביוטיקה, תרופות אנטי דלקתיות,או התערבות כירורגית 3,4,11. אפילו עם טיפולים אלה, ראייה או העין עצמה עלולה ללכת לאיבוד. הפרוגנוזה החזותית לאחר אנדופתלמיטיס חיידקית משתנה בדרך כלל בהתאם ליעילות הטיפול, חדות הראייה במצגת, ואת הארסיות של האורגניזם המדביק.
בצילוס cereus (B. cereus) הוא אחד הפתוגנים החיידקיים העיקריים הגורמים אנדופתלמיטיס פוסטטראומטית 7,12. רוב המקרים B. cereus אנדופתלמיטיס יש כמובן מהיר, אשר יכול לגרום לעיוורון בתוך כמה ימים. סימני ההיכר של B. cereus endophthalmitis כוללים דלקת תוך עינית המתפתחת במהירות, כאבי עיניים, אובדן מהיר של חדות ראייה, וחום. B. cereus גדל במהירות בעין לעומת חיידקים אחרים אשר בדרך כלל לגרוםלדלקות עיניים 2,4,12 ויש לו גורמי ארסיות רבים. לכן, החלון להתערבות טיפוליתמוצלחת הוא קצר יחסית 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. טיפולים בזיהום זה הם בדרך כלל מוצלחים בטיפול אנדופתלמיטיס הנגרמת על ידי פתוגנים פחות ארסיים אחרים, אבל B. cereus endophthalmitis בדרך כלל תוצאות יותר מ 70% מהחולים הסובלים מאובדן ראייה משמעותי. כ -50% מהחולים האלה עוברים סילוק או חינוך של העין הנגועה7,16,22,23. האופי ההרסני והמהר של B. cereus endophthalmitis דורש טיפול מיידי ונכון. ההתקדמות האחרונה בהבחנה המנגנונים הבסיסיים של התפתחות המחלה זיהו יעדים פוטנציאלייםלהתערבות 19,26,27. מודלים ניסיוניים של העכבר של B. cereus אנדופתלמיטיס ממשיכים להיות שימושיים בהבחנה במנגנונים של זיהום ובדיקת טיפולים פוטנציאליים שעשויים למנוע אובדן ראייה.
זיהום תוך עיני ניסיוני של עכברים עם B. cereus כבר מודל אינסטרומנטלי להבנת גורמים חיידקיים ומארח, כמו גם האינטראקציות שלהם, במהלך אנדופתלמיטיס28. מודל זה מחקה אירוע פוסט-טראומטי או פוסט-אופרטיבי, שבו חיידקים מוחכנסים לעין במהלך פציעה. מודל זה ניתן לשחזור רב והיה שימושי לבדיקת טיפולים ניסיוניים ולספק נתונים לשיפורים בסטנדרט הטיפול1,6,19,29,30. כמו מודלים רבים אחרים של זיהום, מודל זה מאפשר שליטה עצמאית בפרמטרים רבים של זיהום ומאפשר בדיקה יעילה ובלתי ניתנת לשחזור של תוצאות הזיהום. מחקרים במודל דומה בארנבים בעשורים האחרונים בחנו את ההשפעות של גורמי ארסיות B. cereus בעין 2,4,13,14,31. על ידי הזרקת B. cereus מוטציה זנים חסרים גורמים בודדים או ארסיים מרובים, התרומה של גורמים אלה ארסיות לחומרת המחלה ניתן למדוד על ידי תוצאות כגון ריכוז של חיידקים בשעות שונות של postinfection אואובדן תפקוד חזותי 13,14,27,31,32. בנוסף, נבדקו גורמים מארחים במודל זה על ידי להדביק זני עכברנוקאאוט חסרים גורמי מארח דלקתיים ספציפיים 26,29,33,34,35. המודל שימושי גם לבדיקת טיפולים פוטנציאליים למחלה זו על ידי הזרקת תרכובות חדשניות לתוך העין לאחרזיהום 30,36. בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט הכולל הדבקת עין העכבר עם B. cereus, קצירת העין לאחר זיהום, כימות עומס חיידקי תוך עיני, ושמירה על דגימות כדי לסמן פרמטרים נוספים של חומרת המחלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אפילו עם הזמינות של אנטיביוטיקה חזקה, תרופות אנטי דלקתיות, ניתוח vitrectomy, אנדופתלמיטיס חיידקי יכול לעוור את המטופל. מחקרים קליניים היו שימושיים בחקר אנדופתלמיטיס; עם זאת, מודלים ניסיוניים של אנדופתלמיטיס מספקים תוצאות מהירות לשחזור שניתן לתרגם להתקדמות ברמת הטיפול, וכתוצאה מכך תוצאה חזותי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר פנג לי ומארק דיטמר (ליבת הדמיה חיה של בעלי חיים OUHSC P30, מכון דין א. מקגי לעיניים, אוקלהומה סיטי, אישור, ארה”ב) על עזרתם. המחקר שלנו נתמך על ידי מענקי מכוני הבריאות הלאומיים R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 ו- R01EY024140. המחקר שלנו נתמך גם על ידי P30EY21725 (מענק NIH CORE להדמיה וניתוח בעלי חיים חיים, ביולוגיה מולקולרית והדמיה תאית). המחקר שלנו נתמך גם על ידי תוכנית המתלמדים הקדם-דוקטורט NEI Vision Science 5T32EY023202, מענק תמיכה במחקר של קרן הבריאות פרסביטריאנית, ומענק בלתי מוגבל למכון דין א. מקגי עין ממחקר למניעת עיוורון.
Materials
| 2-20 µL pipette | RANIN | L0696003G | NA |
| 37oC Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | NA |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 90003-032 | NA |
| Cell Microinjector | MicroData Instrument, Inc. | PM2000 | NA |
| Fine tip forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-122 | NA |
| Glass beads 1.0 mm | BioSpec | 11079110 | NA |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | NB-I2400 | NA |
| Microcapillary Pipets 5 Microliters | Kimble | 71900-5 | NA |
| Micro-Pipette Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | NA |
| Microscope Axiostar Plus | Zeiss | NA | |
| Microscope OPMI Lumera | Zeiss | NA | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | NA |
| Multichannel pipette 30-300 µL | Biohit | 15626090 | NA |
| Multichannel pipette 5-100 µL | Biohit | 9143724 | NA |
| Needle/Pipette Puller | Kopf | 730 | NA |
| PBS | GIBCO | 1897315 | Molecular grade |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Molecular grade |
| Reverse action forceps | Katena | K5-8228 | NA |
References
- Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
- Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
- Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
- Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
- Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
- Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
- Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
- Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
- Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
- Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
- Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
- Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
- Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
- Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
- Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
- Cowan, C. L., Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
- Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
- Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
- Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
- Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
- Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
- David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
- Vahey, J. B., Flynn, H. W. Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
- Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
- Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
- Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
- Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
- Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
- Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
- LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
- Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
- Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
- Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
- Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
- Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
- Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
- LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
- Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
- Beyer, T. L., O’Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
- Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
- Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
- Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
- Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
- Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
- Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
- Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
- Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).
