Intravitreal injektion och kvantisering av infektionsparametrar i en mus modell av bakteriell endoftalmit

Summary

Vi beskriver här en metod för intravitreal injektion och efterföljande bakteriell kvantifiering i mus modell av bakteriell endophthalmitis. Detta protokoll kan utökas för mätning av värd immunsvar och bakterie- och värdgenuttryck.

Abstract

Intraokulära bakterieinfektioner är en fara för synen. Forskare använder djurmodeller för att undersöka värd- och bakteriefaktorer och immunsvarsvägar i samband med infektion för att identifiera livskraftiga terapeutiska mål och för att testa läkemedel för att förhindra blindhet. Den intravitreal injektion tekniken används för att injicera organismer, droger, eller andra ämnen direkt i glaskroppen hålighet i det bakre segmentet av ögat. Här visade vi denna injektion teknik för att inleda infektion i mus öga och tekniken för kvantifiera intraokulära bakterier. Bacillus cereus odlades i hjärnan hjärta infusion flytande media för 18 timmar och resuspended till en koncentration 100 koloni bildar enheter (CFU)/0.5 μL. En C57BL/6J mus var sövda med hjälp av en kombination av ketamin och xylazine. Med hjälp av en picoliter mikroinjektor och glas kapillär nålar, 0,5 μL av Bacillus suspensionen injicerades i mitten glaskroppen av musögat. Det kontralaterala kontrollögat injicerades antingen med sterila medier (kirurgisk kontroll) eller injicerades inte (absolut kontroll). Vid 10 timmar efter infektion, möss avlivades, och ögon skördades med sterila kirurgiska pincett och placeras i ett rör som innehåller 400 μL steril PBS och 1 mm sterila glaspärlor. För ELISAs eller myeloperoxidasanalyser tillsattes proteinashämmare i rören. För RNA-extraktion lades lämplig lysbuffert till. Ögon var homogeniserade i en vävnad homogenisator för 1-2 minuter. Homogenates var serieutspädd 10-faldig i PBS och spår utspädd på agar plattor. Återstoden av homogenatesna lagrades på -80 °C för extra assays. Plattor inkuberades i 24 timmar och CFU per öga kvantifierades. Dessa tekniker resulterar i reproducerbara infektioner i musögon och underlättar kvantisering av livskraftiga bakterier, värden immunsvar, och omics av värd och bakteriell genuttryck.

Introduction

Bakteriell endoftalmit är en förödande infektion som orsakar inflammation, och, om den inte behandlas på rätt sätt, kan resultera i förlust av syn eller blindhet. Endoftalmitis resultat från inträde av bakterier i det inre av ögat¹,^2,3,4,5. En gång i ögat, bakterier replikera, producera toxiner och andra skadliga faktorer, och kan orsaka irreversibla skador på känsliga näthinnans celler och vävnader. Okulära skador kan också orsakas av inflammation, på grund av aktivering av inflammatoriska vägar som leder till inflammatoriska celler tillströmning i det inre av ögat^1,5,6. Endoftalmit kan uppstå efter intraokulär kirurgi (postoperativ), en genomträngande skada på ögat (posttraumatiskt), eller från metastaserande spridning av bakterier in i ögat från en annan anatomisk plats (endogen)^7,8,9,10. Behandlingar för bakteriell endoftalmit inkluderar antibiotika, antiinflammatoriska läkemedel, eller kirurgiskt ingrepp^3,4,11. Även med dessa behandlingar, syn eller ögat i sig kan gå förlorade. Den visuella prognosen efter bakteriell endoftalmit varierar i allmänhet beroende på behandlingseffektiviteten, synskärpan vid presentationen och den infekterande organismens virulens.

Bacillus cereus (B. cereus) är en av de stora bakteriella patogener som orsakar posttraumatisk endoftalmit^7,12. En majoritet av B. cereus endoftalmitis fall har en snabb kurs, vilket kan resultera i blindhet inom några dagar. Kännetecknen för B. cereus endophthalmitis inkluderar snabbt utvecklas intraokulära inflammation, ögonsmärta, snabb förlust av synskärpa, och feber. B. cereus växer snabbt i ögat jämfört med andra bakterier som vanligen orsakar^{ögoninfektioner 2,4,12} och besitter många virulensfaktorer. Därför fönstret för framgångsrik terapeutisk intervention är relativt kort^1, 2^{, 3}, ^{4, 5, 6 ,} 7^{, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25}. Behandlingar för denna infektion är oftast framgångsrika vid behandling av endoftalmit orsakas av andra mindre virulent patogener, men B. cereus endophthalmitis vanligen resulterar i större än 70% av patienter som lider av betydande synförlust. Omkring 50% av dessa patienter genomgår urtagning eller enucleation av det infekterade ögat^7,16,22,23. Den destruktiva och snabba karaktär B. cereus endoftalmitis kräver omedelbar och korrekt behandling. De senaste framstegen när det gäller att urskilja de underliggande mekanismerna för sjukdomsutveckling har identifierat potentiella mål för intervention^19,26,27. Experimentell mus modeller av B. cereus endoftalmitis fortsätta att vara användbara i att urskilja mekanismerna för infektion och testa potentiella therapeutics som kan förhindra synförlust.

Experimentell intraokulär infektion av möss med B. cereus har varit en instrumental modell för att förstå bakterie- och värdfaktorer, liksom deras interaktioner, under endoftalmitis²⁸. Denna modell härmar en posttraumatisk eller postoperativ händelse, där bakterier införs i ögat under en skada. Denna modell är mycket reproducerbar och har varit användbar för att testa experimentella terapier och tillhandahålla data för förbättringar i standard av vård^1,6,19,29,30. Liksom många andra infektionsmodeller möjliggör denna modell oberoende kontroll av många parametrar för infektion och möjliggör effektiv och reproducerbar undersökning av infektionsutfall. Studier i en liknande modell i kaniner under de senaste decennierna har undersökt effekterna av B. cereus virulens faktorer i ögat^2,4,13,14,31. Genom att injicera B. cereus mutantstammar som saknar individuella eller flera virulensfaktorer kan dessa virulensfaktorers bidrag till sjukdomsgradens svårighetsgrad mätas genom utfall som koncentrationen av bakterier vid olika timmar efterinfektion eller förlusten av synfunktionen¹³,^14,27,31,32. Dessutom har värdfaktorer undersökts i denna modell genom att infektera knockout mus stammar saknar specifika inflammatoriska värd faktorer^{26,29,33,34,35}. Modellen är också användbar för att testa potentiella behandlingar för denna sjukdom genom att injicera nya föreningar i ögat efter infektion^30,36. I detta manuskript beskriver vi ett utförligt protokoll som inkluderar infekterar en mus öga med B. cereus, skörd ögat efter infektion, kvantifiera intraokulära bakteriell belastning och bevara exemplar för att assay ytterligare parametrar för sjukdomens allvarlighetsgrad.

Protocol

Alla förfaranden utfördes efter rekommendationerna i handledningen för vård och användning av försöksdjur och Föreningen för forskning i syn och oftalmologi uttalande för användning av djur i oftalmisk och vision forskning. Protokollen godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Oklahoma Health Sciences Center (protokollnummer 15-103, 18-043 och 18-087). 1. Sterila glasnålar Slå på nålpipettdragaren. Justera <s…

Representative Results

Generera en reproducerbar inokulat och noggrannhet av intravitreal injektion förfarandet är viktiga steg i utvecklingen av modeller av mikrobiell endoftalmit. Här, Vi visat den intravitreal injektion förfarande med gram-positiva Bacillus cereus. Vi injicerade 100 CFU/0,5 μL av B. cereus i mitten av glaskroppen av fem C57BL6-möss. Efter 10 h postinfection observerade vi intraokulära tillväxt av B. cereus till cirka 1,8 x 105 CFU/eye. Figur 1 visar…

Discussion

Även med tillgången på potenta antibiotika, antiinflammatoriska läkemedel, och vitrectomy kirurgi, kan bakteriell endoftalmit blind en patient. Kliniska studier har varit användbara i att studera endophthalmitis; emellertid, experimentella modeller av endophthalmitis ge snabb och reproducerbara resultat som kan översättas till framsteg i standard av vård, vilket resulterar i bättre visuella resultatet för patienter.

Musögats glaskroppsvolym är cirka 7 μL⁴⁰….

Materials

2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA