Терапия на основе стволовых клеток стала эффективной стратегией восстановления поврежденных сердечных тканей после инфаркта миокарда. Мы обеспечиваем оптимальное применение in vivo для трансплантации стволовых клеток с использованием желатиновых гидрогелей, которые могут быть энзиматично взаимосвязаны.
Одной из основных проблем, стоящих перед текущей сердечной терапии стволовыми клетками для предотвращения постинфарктной сердечной недостаточности является низкая задержка и выживаемость пересаженных клеток в рамках травмированного миокарда, ограничивая их терапевтическую эффективность. В последнее время использование строительных биоматериалов привлекло внимание к улучшению и максимизации терапии стволовыми клетками. Цель этого протокола заключается в внедрении простого и простого метода трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (MSCs) с использованием инъекционных гидроксифенилпионовой кислоты (GH) гидрогелов; гидрогели являются благоприятными в качестве платформы доставки клеток для сердечной ткани инженерных приложений из-за их способности быть взаимосвязаны на месте и высокой биосовместимости. Мы представляем простой метод для изготовления MSC-загрузки гидрогели GH (MSC/гидрогели) и оценки их выживания и распространения в трехмерной (3D) культуре in vitro. Кроме того, мы демонстрируем методику внутримиокардной трансплантации MSC/гидрогели у мышей, описывающую хирургическую процедуру для индуцирования инфаркта миокарда (МИ) через перевязку коронарной артерии левой передней части (LAD) и последующую трансплантацию MSC/hydrogels.
Терапия стволовыми клетками сердца стала потенциальным подходом к ремонту и регенерации миокарда1,2. Несмотря на недавние положительные результаты в животных моделях и клинических испытаниях, применение терапии на основе стволовых клеток для восстановления миокарда ограничено из-за низкого удержания и плохого выживания инъекционных клеток в инфарктных тканяхсердца 3,4. В результате, использование клеточной инженерии тканей, в том числе инъекционныхбиоматериалов 5,сердечные пятна 6, иклеточные листы 7, был интенсивно изучен для улучшения удержания клеток и интеграции в принимающей миокарда.
Среди различных потенциальных подходов к биоинженерной сердечной ткани ремонт, инъекционные гидрогели в сочетании с соответствующими типами клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (MSCs), эмбриональных стволовых клеток (ESCs), и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), являются привлекательным вариантом для эффективной доставки клеток в миокардарегионах 8,9. Gelatin, известный натуральный полимер, может быть использован в качестве инъекционной матрицы из-за его большой биосовместимости, значительной биоразлагаемости и снижения иммуногенности по сравнению с широким спектром биоматериалов, используемых в биомедицинских приложениях. Хотя инъекционные платформы на основе желатина имеют большой потенциал, их применимость in vivo остается ограниченной в зависимости от их низкой механической жесткости и легкой деградируемости в физиологической среде.
Для преодоления этих ограничений для применения in vivo была предложена новая и простая конструкция гидрогеля на основе желатина, состоящего из гидроксифенил-пропионовой кислоты. Конъюгирует желатин-гидроксифенил пропионовая кислота (GH) может быть взаимосвязана на месте в присутствии фермента, пероксидазы хрена (HRP), а затем инкапсулировать различные препараты, биомолекулы, или клетки в гидрогеле, предлагая большой потенциал вобласти тканевой инженерии приложений 10,11,12,13,14. Кроме того, мы недавно исследовали терапевтические эффекты гидрогели GH, содержащие инкапсулированные MSCs и продемонстрировали их использование в успешном ремонте сердца и регенерации после MI в моделиmurine 15. В этом протоколе мы описываем простой метод инкапсуляции и трехмерного (3D) распространения ПМС в гидрогелях GH. Мы также вводим хирургическую процедуру, предназначенную для генерации модели murine MI с помощью перевязки коронарных артерий и внутримиокардной трансплантации гидрогеля MSC-загрузки GH в инфарктное сердце.
Инъекционные гидрогели GH имеют большой потенциал для in vivo приложений из-за их способности однородно включать различные терапевтические агенты на месте. Кроме того, их физическими и биохимическими свойствами можно легко манипулировать на основе потребностей, зависящих от болезней. В э…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование поддерживается Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (NRF-2018R1D1A1A02049346)
4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
DMEM | Gibco | 11995-065 | |
DPBS | Gibco | 14040-133 | |
Dual-syringe | |||
EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
Forcep | HEBU | HB0458 | |
Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
Iodine | Green Pharmaceutical | ||
LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
Slide scanner | Leica | SCN400 | |
Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |