Denne protokol beskriver brugen af Asymmetrisk Flow Field-Flow Fraktionering kombineret med UV-vis detektion til bestemmelse af størrelsen af en ukendt guld nanopartikel prøve.
Partikelstørrelse er uden tvivl den vigtigste fysisk-kemiske parameter, der er forbundet med begrebet nanopartikel. Præcis viden om størrelsen og størrelsen fordeling af nanopartikler er af allerstørste betydning for forskellige applikationer. Størrelsesområdet er også vigtigt, da det definerer den mest “aktive” komponent i en nanopartikeldosis.
Asymmetrisk Flow Field-Flow Fraktionering (AF4) er en kraftfuld teknik til dimensionering af partikler i suspension i størrelsesområdet på ca. 1-1000 nm. Der er flere måder at udlede størrelsesoplysninger fra et AF4-eksperiment. Ud over at koble AF4 online med størrelsesfølsomme detektorer baseret på principperne om multivinkellysspredning eller dynamisk lysspredning er der også mulighed for at korrelere størrelsen af en prøve med dens retentionstid ved hjælp af en veletableret teoretisk tilgang (FFF-teori) eller ved at sammenligne den med retentionstiderne for veldefinerede partikelstørrelsesstandarder (ekstern størrelseskalibrering).
Vi beskriver her udviklingen og den interne validering af en standardprocedure (SOP) til dimensionering af en ukendt guld nanopartikelprøve af AF4 kombineret med UV-vis-detektion ved hjælp af ekstern størrelseskalibrering med guld nanopartikelstandarder i størrelsesområdet 20-100 nm. Denne procedure giver en detaljeret beskrivelse af den udviklede arbejdsgang, herunder prøveforberedelse, AF4-instrumentopsætning og -kvalifikation, AF4-metodeudvikling og fraktionering af den ukendte guldnanopartikelprøve samt korrelationen mellem de opnåede resultater og den etablerede eksterne størrelseskalibrering. Den SOP, der er beskrevet her, blev til sidst valideret med succes inden for rammerne af en interlaboratorisk sammenligningsundersøgelse, der fremhævede AF4’s fremragende robusthed og pålidelighed til dimensionering af nanopartikelprøver i suspension.
Guld nanopartikler (AuNP) i form af kolloidt guld havde været en del af den menneskelige kultur længe før der var en forståelse af, hvad nanopartikler var, og før udtrykket nanopartikel havde fundet vej ind i moderne, videnskabelige ordforråd. Uden særskilt kendskab til deres nanoskala udseende, suspenderet AuNP var allerede blevet brugt til medicinske og andre formål i det gamle Kina, Arabien og Indien i V-VI århundreder f.Kr.1, og også de gamle romere benyttede sig af deres rubinrøde farve til berømt pletten deres keramik i Lycurgus Cup udstille i British Museum2. I den vestlige verden, gennem århundrederne fra middelalderen til den moderne æra, blev suspenderet AuNP overvejende brugt som farvestoffer til glas og emalje (Purple of Cassius)3 samt til behandling af en række sygdomme (Potable Gold), især syfilis4.
Men alle disse undersøgelser havde primært fokuseret på anvendelsen af suspenderet AuNP, og det var op til Michael Faraday i 1857 at indføre den første rationelle tilgang til at undersøge deres dannelse, deres art samt deres egenskaber5. Selvom Faraday allerede var klar over, at disse AuNP skal have meget små dimensioner, var det ikke før udviklingen af elektronmikroskopi, da eksplicitte oplysninger om deres størrelsesfordeling var tilgængelige6,7, hvilket i sidste ende muliggjorde sammenhængen mellem størrelse og andre AuNP-egenskaber.
I dag, takket være deres forholdsvis let og ligetil syntese, bemærkelsesværdige optiske egenskaber (overfladeplasmon resonans), god kemisk stabilitet og dermed mindre toksicitet samt deres høje alsidighed med hensyn til tilgængelige størrelser og overfladeændringer, har AuNP fundet udbredte anvendelser inden for områder som nanoelektronik8, diagnostik9, kræftbehandling10eller lægemiddellevering11. Det er klart, at for disse anvendelser er præcis viden om størrelsen og størrelsesfordelingen af den anvendte AuNP en grundlæggende forudsætning for at sikre optimal effektivitet12, og der er en betydelig efterspørgsel efter robuste og pålidelige værktøjer til at bestemme denne afgørende fysisk-kemiske parameter. I dag er der en overflod af analytiske teknikker, der er i stand til at dimensionere AuNP i suspension, herunder, for eksempel UV-vis Spectroscopy (UV-vis)13, DLS (Dynamic Light Scattering)14 eller Single Particle Induktivt-Koblet Plasma Mass Spectrometry (spICP-MS)15 med Field-Flow Fractionation (FFF) som en nøglespiller på dette område16,17,18,19,20.
Første konceptualiseret i 1966 af J. Calvin Giddings21, FFF består af en familie af elution-baserede fraktionering teknikker, hvor adskillelse finder sted inden for en tynd, bånd-lignende kanal uden en stationær fase22,23. I FFF fremkaldes adskillelsen af samspillet mellem en prøve og et eksternt kraftfelt, der virker vinkelret på retningen af et laminarkanalflow, hvor prøven transporteres nedstrøms normalt mod respektive in-line detektorer. Blandt disse relaterede FFF-teknikker er Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4), hvor et andet flow (cross flow) fungerer som kraftfelt, blevet den mest anvendte undertype24. I AF4 er kanalbunden (akkumuleringsvæg) udstyret med en semipermeable ultrafiltreringsmembran, der er i stand til at bevare prøven, samtidig med at krydsstrømmen kan passere gennem membranen og forlade kanalen via en ekstra stikkontakt. På denne måde kan krydsstrømmen skubbe prøven mod akkumuleringsvæggen og derved modvirke dens diffusionsinducerede flux (Brownian-bevægelse). I en deraf følgende ligevægt af felt- og diffusionsinducerede fluxer; mindre prøvebestanddeler, der udviser højere diffusionskoefficienter, flugter tættere på kanalcentret, mens større prøvebestanddeler, der udviser lavere diffusionskoefficienter, finder tættere på akkumuleringsvæggen. På grund af den parabolske strømningsprofil inde i kanalen transporteres mindre prøvebestanddele derfor i kanalstrømmens hurtigere laminae og lut før større prøvebestanddele. Ved hjælp af FFF retention parameter og Stokes-Einstein diffusion koefficient ligninger, eluering tid og henholdsvis eluering volumen, af en prøve i AF4 kan derefter direkte oversættes til sin hydrodynamiske størrelse22. Her henviser den beskrevne elueringsfunktion til den normale elueringstilstand og er normalt gyldig for AF4 inden for et partikelstørrelsesområde mellem ca. 1-500 nm (nogle gange op til 2000 nm afhængigt af partikelegenskaber og fraktioneringsparametre), mens sterisk-hyperlayer elution normalt forekommer over denne størrelsesgrænse25.
Der er tre almindelige måder at udlede størrelsesoplysninger efter FFF’s separation. Da FFF er et modulopbygget instrument, kan det kombineres nedstrøms medfleredetektorer,f.eks. Men da en prøves fastholdelsesadfærd i en FFF-kanal generelt styres af veldefinerede fysiske kræfter, kan størrelsen også beregnes ved hjælp af en matematisk tilgang (FFF-teori), hvor en simpel koncentrationsdetektor (f.eks. en UV-vis-detektor) er tilstrækkelig til at indikere tilstedeværelsen af en elutingprøve32,33.
Som en tredje mulighed rapporterer vi her anvendelsen af en ekstern størrelseskalibrering34,35 ved hjælp af veldefinerede AuNP-standarder i størrelsesområdet 20-100 nm til dimensionering af en ukendt guld nanopartikelprøve i suspension ved hjælp af AF4 kombineret med UV-vis-detektion. Denne enkle eksperimentelle opsætning blev valgt med vilje for at give så mange laboratorier som muligt mulighed for at deltage i en international interlaboratorisk sammenligning (ILC), som senere blev udført inden for rammerne af EU Horizon 2020-projektet ACEnano baseret på den protokol, der præsenteres her.
Den hydrodynamiske størrelse af en ukendt AuNP blev nøjagtigt vurderet af AF4 kombineret med en UV-vis-detektor ved hjælp af veldefinerede AuNP-størrelsesstandarder fra 20 nm til 100 nm. Den udviklede AF4-metode blev optimeret ved hjælp af en konstant krydsstrømsprofil for at etablere et lineært forhold mellem målt retentionstid og AuNP-størrelse, hvilket giver mulighed for en ligetil størrelsesbestemmelse fra lineær regressionsanalyse. Der var også særlig fokus på at opnå tilstrækkeligt høje genvindingsrater, der ikke tydede på noget signifikant prøvetab under fraktioneringen, og at den udviklede AF4-metode, herunder den anvendte eluerings- og membran, passede godt sammen med alle fraktionerede AuNP-prøver.
Metodeudvikling er uden tvivl det mest kritiske skridt i AF4, og flere parametre, herunder kanaldimensioner, flowparametre samt eluering, membran, afstandshøjde og endda prøveegenskaber, skal tages i betragtning for at forbedre fraktionering inden for et givet elution-tidsvindue. Formålet med dette afsnit er at guide læseren gennem de kritiske trin, der blev optimeret til med succes at bestemme størrelsen på det ukendte AuNP-eksempel, der diskuteres her. For en mere detaljeret beskrivelse af, hvordan man generelt udvikler en AF4-metode, henvises læseren til AF4-afsnittet i ‘ISO/TS21362:2018 – Nanoteknologi – Analyse af nanoobjekter ved hjælp af asymmetrisk flow og centrifugalfeltflowfraktionering’25. Under et nærmere kig på de anvendte fraktioneringsbetingelser i tabel 3er det første kritiske skridt indførelsen og lempelsen af AuNP-prøven i AF4-kanalen. Dette trin styres af injektionsflowet, fokusflowet og krydsstrømmen, hvis samspil tvinger prøven til at lokalisere tæt på membranoverfladen og koncentrere den i et smalt bånd nær AF4-kanalens injektionsport, der dybest set definerer udgangspunktet for fraktioneringen. En tilstrækkelig lempelse af prøven er obligatorisk, da prøvebestanddeler i forskellige størrelser i forskellige højder af AF4-kanalen i dette trin derved danner grundlag for en vellykket størrelsesfraktionering. Ufuldstændig prøveafslapning er normalt synlig ved et øget tomrumstopområde som følge af ikke-rodfæstede (dvs. ikke-afslappede) prøvebestanddeler. Denne effekt kan afbødes ved at øge injektionstiden og/eller den anvendte tværstrømshastighed. Begge parametre har dog brug for omhyggelig optimering, især for prøver, der er tilbøjelige til agglomeration og adsorption på AF4-membranen, og kan overvåges af de respektive gendannelseshastigheder opnået for forskellige parameterindstillinger36,37. Den anvendte injektionstid på 5 minutter sammen med en krydsstrømshastighed på 1,0 mL∙min-1 afslørede restitutionshastigheder >80% for alle AuNP-prøver og et ubetydeligt tomrumstopområde, der indikerer næsten optimale afslapningsforhold. Efter tilstrækkelig lempelse af AuNP-prøven blev fokusflowet stoppet, og der blev indledt prøvetransport langs AF4-kanallængden til den respektive UV-vis-detektor, der repræsenterede det andet kritiske trin. For at sikre tilstrækkelig høj fraktioneringseffekt ved rimelige analysetider blev der anvendt en konstant krydsstrømshastighed på 1,0 mL∙min-1 i 30-50 min. (afhængigt af den respektive fraktionerede AuNP-størrelsesstandard) efterfulgt af et 10 min lineært krydsstrømsfald ved en detektorstrømshastighed på 0,5 mL.min.-1. Brug af en konstant krydsstrømsprofil på tværs af adskillelsen af alle AuNP-størrelsesstandarder afslørede et lineært forhold mellem retentionstid og AuNP-størrelse efter FFF-teori22, hvilket muliggjorde størrelsesbestemmelse af den ukendte AuNP-prøve ved simpel lineær regressionsanalyse. Imidlertid er andre profiler end en konstant krydsstrøm også blevet udnyttet til dimensionering af nanopartikler , hvilket i sidste ende fører til et ikke-lineært forhold mellem retentionstid og partikelstørrelse38,39. Desuden er størrelsesbestemmelse i AF4 ved hjælp af veldefinerede størrelsesstandarder ikke begrænset til AuNP, men kan også anvendes på nanopartikler med andre størrelser og elementær sammensætning (f.eks. sølv38,40 eller silica nanopartikler41,42). Derudover er ICP-MS, når man arbejder med fortyndede prøver, en meget følsom elementær detektor, som kan kombineres med AF4, hvilket øger alsidigheden af denne analytiske tilgang til dimensionering af en lang række nanopartikler i suspension.
På trods af sin udbredte anvendelse, ekstern størrelse kalibrering ved hjælp af veldefinerede størrelse standarder i AF4 har nogle særegenheder, der skal overvejes, når du bruger det til nøjagtig dimensionering af ukendte prøver. For det første er den stærkt afhængig af anvendelsen af sammenlignelige betingelser under fraktioneringen af de respektive størrelsesstandarder og den faktiske stikprøve. I det tilfælde, der præsenteres her, er det derfor obligatorisk, at både AuNP-størrelsesstandarderne og den ukendte AuNP-prøve fraktioneres ved hjælp af den samme AF4-metode samt den samme eluent og den samme membran, hvilket gør denne tilgang ret ufleksibel. Da der ikke findes størrelsesfølsomme detektorer, f.eks. Dette gælder især for ukendte prøver, der udviser meget brede størrelsesfordelinger, hvor det fortsat er uklart, om alle prøvebestanddeler følger det normale elueringsmønster: fraktionering fra mindre til større partikler, eller om større prøvebestanddeler allerede lusker i sterisk-hyperlayertilstand og derved potentielt co-eluting med mindre prøvebestanddeler43,44. Hertil kommer, at selvom FFF-teori understreger, at AF4 udelukkende adskiller sig udelukkende baseret på forskelle i hydrodynamisk størrelse med partikler, der betragtes som punktmasser uden interaktioner med deres miljø22, fortæller virkeligheden en anden historie med partikelpartikel- og partikelmembraninteraktioner. (såsom elektrostatisk tiltrækning/ frastødning eller van-der-Waals attraktion) kan spille en betydelig rolle og kan potentielt indføre en målbar bias i størrelsesbestemmelser via ekstern størrelseskalibrering45,46. Det anbefales derfor at anvende størrelsesstandarder, der ideelt set svarer til sammensætningen og overfladeegenskaberne (Zeta-potentialet) af den pågældende partikel40,42 eller, hvis disse ikke er tilgængelige, i det mindste anvende velkaraktererede partikelstørrelsesstandarder (f.eks. polystyren latexpartikler) og omhyggeligt vurdere deres sammenlignelighed med den pågældende partikel, især med hensyn til deres overflade Zeta-potentiale i det respektive miljø, hvor analysen skal udføres41,47.
Alsidigheden af AF4 betragtes ofte som sin største styrke, da den tilbyder et applikationsområde, der går ud over de fleste andre almindelige størrelsesteknikker på dette område22,48,49. Samtidig kan det på grund af dets tilknyttede formentlig kompleksitet også betragtes som dets største ulempe, især mod hurtige og angiveligt brugervenlige størrelsesteknikker som DLS, Nanopartikelsporingsanalyse eller ICP-MS med en enkelt partikel. Ikke desto mindre, når man sætter AF4 i perspektiv med disse populære dimensioneringsteknikker, bliver det klart, at alle teknikker har deres fordele og ulemper, men alle bidrager til en mere omfattende forståelse af nanopartiklernes fysisk-kemiske karakter og bør derfor betragtes som komplementære snarere end konkurrencedygtige.
Standarddriftsproceduren (SOP), der præsenteres her, fremhæver den fremragende anvendelighed af AF4-UV-vis med ekstern størrelseskalibrering til dimensionering af en ukendt AuNP-prøve i suspension og blev til sidst anvendt som en anbefalet retningslinje for AF4-analyse af en ukendt AuNP-prøve inden for en international interlaboratorisk sammenligning (ILC), der blev udført inden for rammerne af Horizon 2020-projektet, ACEnano (resultatet af denne ILC vil være genstand for en fremtidig publikation). Denne protokol, derfor tilføjer op til den opmuntrende og igangværende internationale bestræbelser på at validere og standardisere AF4 metoder25,50,51,52 understreger lovende potentiale AF4 inden for nanopartikel karakterisering.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke hele ACEnano-konsortiet for frugtbare drøftelser i alle faser af udarbejdelsen af den protokol, der præsenteres her. Forfatterne sætter også pris på finansiering fra EU Horizon 2020-programmet (H2020) i henhold til tilskudsaftale nº 720952 inden for rammerne af ACEnano-projektet.
0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) | Postnova Analytics GmbH | Z-FIL-TEF-002 | Used for filtration of aqueous solutions |
0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) | Merck Millipore | Durapore Millex | Used for filtration of NovaChem100 |
Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) | Eppendorf AG | Research Plus | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
AF4 cartridge | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF – AF4 Analytical Channel | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
AF4 Membrane – Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) | Postnova Analytics GmbH | Z-AF4-MEM-612-10KD | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Analytical Balance (0.1 mg precision) | Sartorius | ENTRIS124I-1S | Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution |
Autosampler | Postnova Analytics GmbH | PN5300 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Channel Oven | Postnova Analytics GmbH | PN4020 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Crossflow Module | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF Control Module | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Disposable Pipette Tips (1000 µL) | Eppendorf AG | ep T.I.P.S | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
Flasks (e.g. 2 liter volume) | neoLab | 1-0199 | Used for eluent storage |
Focus Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1131 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | VIA-002 | Used for sample storage |
Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) | Postnova Analytics GmbH | NovaCal Gold | 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function |
Magnetic Stirrer | IKA | VIBRAX-VXR | Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW |
Personal Computer (PC) | Dell Technologies | / | Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) | / | / | In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials |
Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | Z-VIA-09150868 | Used for sample storage |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade | Carl Roth GmbH & Co KG | 2326.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a | Carl Roth GmbH & Co KG | 6771.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
Software Package for Control and Data Acquisition | Postnova Analytics GmbH | NovaFFF AF2000 Software | Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
Software Package for Data Evaluation | Postnova Analytics GmbH | NovaAnalysis Software | Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual |
Software Package for final Data Processing | OriginLab Corporation | Origin 2019 | Used for final data processing |
Solvent Degasser | Postnova Analytics GmbH | PN7520 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Solvent Selector | Postnova Analytics GmbH | PN7310 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Solvent Organizer | Postnova Analytics GmbH | PN7140 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Surfactant Mixture | Postnova Analytics GmbH | NovaChem100 | Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation |
Tip Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1130 | Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
Unknown AuNP sample | BBI Solutions | EM.GC60 | 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function |
UV-vis Detector | Postnova Analytics GmbH | PN3211 | UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system |
Vacuum Filtration Unit | Postnova Analytics GmbH | Eluent Filtration System | Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions |
Vortex | IKA | Vortex Genie 2 | Used for homogenization of diluted AuNP suspensions |
Water Purification System | Merck Millipore | Milli-Q Integral 5 | Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions |