ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות
Summary
בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.
Abstract
ההצלחה של השתלת רקמה שגודלה במעבדה או מכשיר רפואי באדם כפופה לתגובה החיסונית של המארח המקבל. בהתחשב בשתל כגוף זר, תגובה חיסונית עוינת ולא מווסתת עלולה לגרום לדחיית השתל, בעוד תגובה מווסתת והחזרת הומאוסטזיס יכולה להוביל לקבלתו. ניתוח המיקרו-סביבות של שתלים המנותחים תחת הגדרות de vivo או ex vivo יכול לסייע בהבנת דפוס התגובה החיסונית, אשר בסופו של דבר יכול לסייע בפיתוח דורות חדשים של ביו-חומרים. ציטומטריית זרימה היא טכניקה ידועה לאפיון תאי מערכת החיסון ותת-קבוצותיהם בהתבסס על סמני פני התא שלהם. סקירה זו מתארת פרוטוקול המבוסס על חיתוך ידני, עיכול אנזימטי וסינון באמצעות מסננת תאים לבידוד מתרחיפים אחידים של תאים מרקמת השתל המנותחת. יתר על כן, הוסבר פרוטוקול צביעת ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים, יחד עם שלבים להגדרות ציטומטר ראשוניות כדי לאפיין ולכמת תאים מבודדים אלה על ידי ציטומטריית זרימה.
Introduction
ההתקדמות בתחום הרפואה הובילה לשימוש תכוף בחומרים מושתלים לתמיכה בתפקוד או צמיחה מחדש של רקמות פגועות 1,2. אלה כוללים מכשירים כגון קוצבי לב, שתלים קוסמטיים משחזרים, ולוחות אורתופדיים המשמשים לקיבוע שבר עצם 3,4. עם זאת, החומרים המשמשים לייצור שתלים אלה והמיקומים שבהם הם מושתלים ממלאים תפקיד חשוב בקביעת ההצלחה של שתלים אלה 5,6,7. כגופים זרים, שתלים אלה יכולים ליצור תגובה חיסונית מהמארח שיכולה להוביל לדחייה או לסבילות8. גורם זה הניע את המחקר הביו-חומרי ליצור חומרים שיכולים למשוך את התגובה החיסונית הרצויה לאחר ההשתלה 9,10,11,12.
התגובה החיסונית היא דרישה חיונית בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כאשר רקמה או איבר גדלים סביב שלד ביו-חומרי (פיגום) במעבדה להחלפת רקמה או איבר פגומים13,14,15,16. ברפואה רגנרטיבית, המטרה היא להחליף רקמות חסרות או פגומות באמצעות שימוש בתאים, אותות ופיגומים, שכל אחד מהם יכול להיות מווסת במידה רבה על ידי תגובות חיסוניות17. יתר על כן, גם כאשר רוצים חוסר תגובה חיסונית, לעיתים רחוקות מאוד מדובר בהיעדר פעילות חיסונית ולא בנוכחות פרופיל ויסות רצוי18 . טכניקות כגון ציטומטריית זרימה יכולות למלא תפקיד משמעותי באפיון דפוס התגובה החיסונית לביו-חומרים שונים המשמשים לציפוי מכשירי שתלים או לפיתוח פיגומים להנדסת רקמות19.
מידע זה, בתורו, יסייע בסופו של דבר בפיתוח ביו-חומרים לשתלים שיכולים להיות נסבלים היטב על ידי מערכת החיסון או בפיתוח פיגומים שיכולים למלא תפקיד בונה בהנדסת רקמות. הכנה נכונה של דגימות לניתוח לפי ציטומטריית זרימה היא צעד חשוב למניעת תוצאות לא מדויקות באפיון חיסוני באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי20,21. לכן, סקירה זו מציגה מתודולוגיה מפורטת שניתן להשתמש בה לבידוד תאים מרקמת פיגום, צביעת תרחיף התא וניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
סקירה זו מתארת מתודולוגיה מפורטת לבידוד תאים משתלים ביו-חומריים להשגת תרחיף תאים אחיד. בנוסף, סופק פרוטוקול מפורט לצביעת תרחיף התא עבור ציטומטריית זרימה צבעונית, יחד עם השלבים להגדרת ציטומטר זרימה לקבלת תוצאות אופטימליות. שיטות בידוד תאים יכולות לכלול שלבים מרובים, לעתים קרובות באמצעות ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלי של ה-NIH, כולל המכון הלאומי לדימות ביו-רפואי וביו-הנדסה. כתב ויתור: ה-NIH, נושאי המשרה שלו ועובדיו אינם ממליצים או תומכים בשום חברה, מוצר או שירות.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. Engineering antigen-specific immunological tolerance. Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. . Practical Flow Cytometry. , (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
