Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes
Summary
O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.
Abstract
O sucesso da implantação de tecido cultivado em laboratório ou de um dispositivo médico em um indivíduo está sujeito à resposta imune do hospedeiro receptor. Considerando um implante como um corpo estranho, uma resposta imune hostil e desregulada pode resultar na rejeição do implante, enquanto uma resposta regulada e recuperação da homeostase podem levar à sua aceitação. A análise dos microambientes de implantes dissecados em ambientes de vivo ou ex vivo pode ajudar na compreensão do padrão de resposta imune, o que pode, em última análise, ajudar no desenvolvimento de novas gerações de biomateriais. A citometria de fluxo é uma técnica bem conhecida para caracterizar células imunes e seus subgrupos com base em seus marcadores de superfície celular. Esta revisão descreve um protocolo baseado em cubagem manual, digestão enzimática e filtração através de um filtro celular para o isolamento de suspensões celulares uniformes do tecido dissecado do implante. Além disso, um protocolo de coloração por citometria de fluxo multicolor foi explicado, juntamente com as etapas para ajustes iniciais do citômetro para caracterizar e quantificar essas células isoladas por citometria de fluxo.
Introduction
Os avanços no campo da medicina têm levado ao uso frequente de materiais implantados para apoiar a função ou o recrescimento do tecido lesado 1,2. Estes incluem dispositivos como marca-passos, implantes cosméticos reconstrutivos e placas ortopédicas usadas para fixação de fraturas ósseas 3,4. No entanto, os materiais utilizados para a confecção desses implantes e os locais em que são implantados desempenham papéis importantes na determinação do sucesso desses implantes 5,6,7. Como corpos estranhos, esses implantes podem gerar uma resposta imune do hospedeiro que pode levar à rejeição ou tolerância8. Esse fator tem direcionado a pesquisa de biomateriais para gerar materiais que possam atrair a resposta imune desejada após o implante 9,10,11,12.
A resposta imune é um requisito essencial no campo da medicina regenerativa, onde um tecido ou órgão é cultivado ao redor de um esqueleto de biomaterial (scaffold) em laboratório para a substituição de um tecido ou órgão danificado13,14,15,16. Na medicina regenerativa, o objetivo é repor o tecido perdido ou danificado por meio do uso de células, sinais e arcabouços, cada um dos quais pode ser grandemente modulado por respostas imunes17. Além disso, mesmo quando a falta de resposta imune é desejada, é muito raramente uma ausência de atividade imunológica em vez da presença de um perfil regulatório desejado18. Técnicas como a citometria de fluxo podem desempenhar um papel significativo na caracterização do padrão de resposta imune a vários biomateriais utilizados para revestir dispositivos de implante ou para desenvolver scaffolds para engenharia de tecidos19.
Essas informações, por sua vez, ajudarão no desenvolvimento de biomateriais para implantes que podem ser bem tolerados pelo sistema imunológico ou no desenvolvimento de arcabouços que podem desempenhar um papel construtivo na engenharia de tecidos. O preparo adequado das amostras para análise por citometria de fluxo é um passo importante para evitar resultados imprecisos na imunocaracterização via triagem celular ativada porfluorescência20,21. Portanto, esta revisão apresenta uma metodologia detalhada que pode ser utilizada para o isolamento de células de tecido de arcabouço, coloração da suspensão celular e análise por citometria de fluxo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta revisão descreve uma metodologia detalhada para isolar células de implantes de biomateriais para obter uma suspensão celular uniforme. Além disso, um protocolo detalhado foi fornecido para coloração da suspensão celular para citometria de fluxo multicolorida, juntamente com as etapas para a configuração de um citômetro de fluxo para resultados ótimos. Os métodos de isolamento celular podem envolver várias etapas, muitas vezes utilizando dissecção manual do tecido seguida de digestão enzimática com e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, incluindo o Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia. Isenção de responsabilidade: Os NIH, seus diretores e funcionários não recomendam ou endossam qualquer empresa, produto ou serviço.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. Engineering antigen-specific immunological tolerance. Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. . Practical Flow Cytometry. , (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
