Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati
Summary
L’isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro caratterizzazione mediante citometria a flusso possono contribuire in modo significativo alla comprensione del modello di risposta immunitaria contro gli impianti. Questo articolo descrive un metodo preciso per l’isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro colorazione per l’analisi citofluorimetrica.
Abstract
Il successo dell’impianto di un tessuto coltivato in laboratorio o di un dispositivo medico in un individuo è soggetto alla risposta immunitaria dell’ospite ricevente. Considerando un impianto come un corpo estraneo, una risposta immunitaria ostile e disregolata può portare al rigetto dell’impianto, mentre una risposta regolata e il recupero dell’omeostasi possono portare alla sua accettazione. L’analisi dei microambienti degli impianti sezionati in ambienti in vivo o ex vivo può aiutare a comprendere il modello di risposta immunitaria, che può in ultima analisi aiutare nello sviluppo di nuove generazioni di biomateriali. La citometria a flusso è una tecnica ben nota per caratterizzare le cellule immunitarie e i loro sottogruppi in base ai loro marcatori di superficie cellulare. Questa revisione descrive un protocollo basato sul taglio manuale a cubetti, la digestione enzimatica e la filtrazione attraverso un filtro cellulare per l’isolamento di sospensioni cellulari uniformi dal tessuto implantare sezionato. Inoltre, è stato spiegato un protocollo di colorazione della citometria a flusso multicolore, insieme ai passaggi per le impostazioni iniziali del citometro per caratterizzare e quantificare queste cellule isolate mediante citometria a flusso.
Introduction
I progressi nel campo della medicina hanno portato all’uso frequente di materiali impiantati per sostenere la funzione o la ricrescita del tessuto danneggiato 1,2. Questi includono dispositivi come pacemaker, impianti cosmetici ricostruttivi e placche ortopediche utilizzate per la fissazione delle fratture ossee 3,4. Tuttavia, i materiali utilizzati per realizzare questi impianti e le posizioni in cui vengono impiantati giocano un ruolo importante nel determinare il successo di questi impianti 5,6,7. Come corpi estranei, questi impianti possono generare una risposta immunitaria da parte dell’ospite che può portare al rigetto o alla tolleranza8. Questo fattore ha spinto la ricerca sui biomateriali a generare materiali in grado di attrarre la risposta immunitaria desiderata dopo l’impianto 9,10,11,12.
La risposta immunitaria è un requisito essenziale nel campo della medicina rigenerativa, dove un tessuto o un organo viene coltivato attorno a uno scheletro biomateriale (scaffold) in laboratorio per la sostituzione di un tessuto o di un organo danneggiato13,14,15,16. Nella medicina rigenerativa, l’obiettivo è quello di sostituire il tessuto mancante o danneggiato attraverso l’uso di cellule, segnali e scaffold, ognuno dei quali può essere notevolmente modulato dalle risposte immunitarie17. Inoltre, anche quando si desidera una mancanza di risposta immunitaria, molto raramente si tratta di un’assenza di attività immunitaria piuttosto che della presenza di un profilo regolatorio che è auspicabile18. Tecniche come la citometria a flusso possono svolgere un ruolo significativo nella caratterizzazione del modello di risposta immunitaria a vari biomateriali utilizzati per il rivestimento di dispositivi implantari o per lo sviluppo di scaffold per l’ingegneria tissutale19.
Queste informazioni, a loro volta, aiuteranno in ultima analisi nello sviluppo di biomateriali per impianti che possono essere ben tollerati dal sistema immunitario o nello sviluppo di scaffold che possono svolgere un ruolo costruttivo nell’ingegneria tissutale. La corretta preparazione dei campioni per l’analisi mediante citometria a flusso è un passo importante per evitare risultati imprecisi nella caratterizzazione immunitaria tramite lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza20,21. Pertanto, questa revisione presenta una metodologia dettagliata che può essere utilizzata per l’isolamento di cellule dal tessuto dell’impalcatura, la colorazione della sospensione cellulare e l’analisi mediante citometria a flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa revisione descrive una metodologia dettagliata per isolare le cellule da impianti di biomateriali per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Inoltre, è stato fornito un protocollo dettagliato per la colorazione della sospensione cellulare per la citometria a flusso multicolore, insieme ai passaggi per la configurazione di un citometro a flusso per ottenere risultati ottimali. I metodi di isolamento cellulare possono comportare più fasi, spesso utilizzando la dissezione manuale dei tessuti seguita dalla dig…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata in parte dal programma di ricerca intramurale del NIH, tra cui il National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Dichiarazione di non responsabilità: il NIH, i suoi funzionari e dipendenti non raccomandano o approvano alcuna azienda, prodotto o servizio.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
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