גישה שיטתית לזיהוי מולקולות אנטי-מיקרוביאליות ואנטיביופילם חדשניות מתמציות ושברים של צמחים למניעת עששת שיניים
Summary
מוצרים טבעיים מייצגים נקודות התחלה מבטיחות לפיתוח תרופות חדשות וסוכנים טיפוליים. עם זאת, בשל המגוון הכימי הגבוה, מציאת תרכובות טיפוליות חדשות מצמחים היא משימה מאתגרת וגוזלת זמן. אנו מתארים גישה פשוטה לזיהוי מולקולות מיקרוביאלית ואנטיביופילם מתמציות צמחים ושברים.
Abstract
מוצרים טבעיים מספקים חומרים שונים מבחינה מבנית, עם מספר עצום של פעילויות ביולוגיות. עם זאת, הזיהוי והבידוד של תרכובות פעילות מצמחים מאתגרים בשל מטריצת הצמח המורכבת ונהלי הבידוד והזיהוי שגוזלים זמן רב. לכן, גישה צעד צעד לסינון תרכובות טבעיות מצמחים, כולל בידוד וזיהוי של מולקולות פעיל פוטנציאלי, מוצג. הוא כולל את האוסף של החומר הצמחי; הכנה ושבר של תמציות גולמיות; כרומטוגרפיה וספקטרומטריה (UHPLC-DAD-HRMS ו- NMR) גישות לניתוח וזיהוי תרכובות; bioassays (פעילויות מיקרוביאלית ואנטיביופילם; חיידקי “חוזק הידבקות” גלולה הרוק מטריצה גלוקן הראשונית שטופלו בטיפולים נבחרים); וניתוח נתונים. המודל הוא פשוט, לשחזור, ומאפשר סינון תפוקה גבוהה של תרכובות מרובות, ריכוזים, וצעדי טיפול ניתן לשלוט באופן עקבי. הנתונים המתקבלים מספקים את הבסיס למחקרים עתידיים, כולל ניסוחים עם התמציות ו/או השברים הפעילים ביותר, בידוד מולקולות, מידול מולקולות למטרות ספציפיות בתאים מיקרוביאליים וביופילמים. לדוגמה, מטרה אחת לשלוט בביופילם קריוגני היא לעכב את הפעילות של ריר סטרפטוקוקוס glucosyltransferases לסנתז את הגלוקנים של המטריצה החוץ תאית. העיכוב של אנזימים אלה מונע הצטברות ביופילם, הפחתת הארסיות שלה.
Introduction
המודלים המוקדמים ביותר של הרפואה המשמשים בחברות התבססו על מוצרים טבעיים (NPs). מאז, בני אדם מחפשים כימיקלים חדשים בטבע שניתן להפוך לסמים1. חיפוש זה גרם לשיפור מתמשך של טכנולוגיות ושיטות לסינון אתנובוטני1,2,3. NPs מציעים מקור עשיר של חומרים מגוונים מבחינה מבנית, עם מגוון רחב של פעילויות ביולוגיות שימושיות לפיתוח טיפולים חלופיים או אדג’ובנטיים. עם זאת, מטריצת הצמח המורכבת אינהרנטית הופכת את הבידוד והזיהוי של התרכובות הפעילות למשימה מאתגרת וגוזלת זמן4.
תרופות מבוססות NPs או ניסוחים ניתן להשתמש כדי למנוע ו / או לטפל במספר תנאים המשפיעים על הפה, כולל עששת שיניים4. עששת דנטלית, אחת המחלות הכרוניות הנפוצות ביותר בעולם, נובעת מהאינטראקציה של תזונה עשירה בסוכר וביופילמים מיקרוביאליים (פלאק דנטלי) הנוצרים על משטח השן שמוביל לדמינרליזציה הנגרמת על ידי חומצות אורגניות המופקות מחילוף חומרים מיקרוביאלי, ואם לא מטופלים, מובילה לאובדן שיניים5,6. למרות מיקרואורגניזמים אחרים עשויים להיות קשורים 7 , ריר סטרפטוקוקוס הואחיידקקריוגני קריטי כי זה אסידוגני, חומצי, ובונה מטריצה חוץ תאית. מין זה מקודד exoenzymes מרובים (למשל, glycosyltransferases או Gtfs) המשתמשים סוכרוז כמומצע 8 כדי לבנות את המטריצה חוץ תאית עשיר exopolysaccharides, שהם ארסית דטרמיננטי9. כמו כן, הפטרייה קנדידה אלביקנס יכול להגביר את הייצור של מטריצה חוץ תאית7. אמנם פלואוריד, מנוהל באופנים שונים, נשאר הבסיס למניעת עששת שיניים10, גישות חדשות נדרשות כמו אדג’ובאנטים כדי להגדיל את האפקטיביות שלה. בנוסף, אופני האנטי-פלאק הזמינים מבוססים על שימוש בסוכנים מיקרובידיאליים רחבי טווח (למשל, כלורהקסידין)11. כחלופה, NPs הם טיפולים פוטנציאליים לשליטה בביופילמים ומניעת עששת שיניים12,13.
ההתקדמות הנוספת בגילוי תרכובות ביו-אקטיביות חדשות מצמחים כוללת צעדים או גישות הכרחיים כגון: (i) שימוש בפרוטוקולים אמינים וניתנים לשחזור לדגימה, בהתחשב בכך שצמחים מראים לעתים קרובות שונות תוך-ספציפית; (ii) הכנת תמציות מקיפות והשברים שלהן בקנה מידה קטן; (iii) האפיון ו/או dereplication של הפרופילים הכימיים שלהם חשבו רכישת נתונים רב ממדיים כגון GC-MS, LC-DAD-MS, או NMR, למשל; (iv) שימוש במודלים בני קיימא ותפוקה גבוהה להערכת ביואקטיביות; (v) בחירת כניסות חדשות פוטנציאליות המבוססות על ניתוח נתונים רב-משתני או כלים סטטיסטיים אחרים; (ו) לבצע בידוד וטיהור של תרכובות ממוקדות או מועמדים מבטיחים; ו -(vii) אימות הפעילויות הביולוגיות המתאימות באמצעות התרכובות המבודדות2,14.
Dereplication הוא תהליך של זיהוי מהיר של תרכובות ידועות תמצית גולמית ומאפשר להבדיל תרכובות הרומן מאלה שכבר נחקרו. חוץ מזה, תהליך זה מונע בידוד כאשר ביואקטיביות כבר תוארה עבור תרכובות מסוימות, וזה מועיל במיוחד לזהות “חובטים תכופים”. זה שימש בתהליכי עבודה שונים untargeted החל זיהוי תרכובת גדולה או האצה של שבר מונחה פעילות עד פרופיל כימי של אוספים של תמציות. זה יכול להיות משולב באופן מלא עם מחקרים metabolomic עבור פרופיל כימי untargeted של CE או זיהוי ממוקד של מטבוליטים. כל זה מוביל בסופו של דבר לתעדוף תמציות לפני הליכי הבידוד1,15,16,17.
לכן, בכתב היד הנוכחי, אנו מתארים גישה שיטתית לזיהוי מולקולות מיקרוביאלית ואנטיביופילם מתמציות צמחים ושברים. הוא כולל ארבעה שלבים רב תחומיים: (1) איסוף של חומר צמחי; (2) הכנת תמציות גולמיות (CE) ושברים (CEF), ואחריו ניתוח הפרופיל הכימי שלהם; (3) ביו-אסאי; ו-(4) ניתוחי נתונים ביולוגיים וכימיים (איור 1). לכן, אנו מציגים את הפרוטוקול שפותח כדי לנתח את הפעילויות מיקרוביות ואנטיביופילם של תמציות סילבסטריס קיסטריה שברים נגד ריר סטרפטוקוקוס קנדידה אלביקנס13, כמו גם את ההליכים עבור אפיון פיטוכימי וניתוח נתונים. לפשטות, המוקד כאן הוא להדגים את הגישה לסינון תרכובות טבעיות באמצעות החיידק.
איור 1: תרשים זרימה של הגישה השיטתית לזיהוי מולקולות פעילות מתמציות ושברים של צמחים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
האתגרים העיקריים הקשורים לעבודה עם תמציות גולמיות טבעיות מרכיבים את הרכבם המורכב ואת הליקויים של מחקרי בידוד ביו-מונחים קלאסיים. למרות שתהליך זה איטי, הוא יעיל והוביל לממצאים משמעותיים במחקר NP. כדי לתרץ, דרושים מחקרים מונחי תעדוף כדי לתרץ. לכן, השימוש בגישות פרופיל כימי מודרני לניתוח CE ו de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מביעים את תודתנו לנוקלו דה ביונסאיוס, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) של המכון לכימיה של UNESP, Araraquara / SP לאספקת המעבדות להכנת חומר צמחי. אנו מודים גם למעבדה המיקרוביולוגית היישומית של המחלקה לחומרי שיניים ופרוסטודונטיה, UNESP, Araraquara / SP. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר מקרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP #2013/07600-3 ל- AJC) ומלגות בתוספת קרנות תקורה (FAPESP #2017/07408-6 ו- FAPESP #2019/23175-7 ל- SMR; #2011/21440–3 ו-#2012/21921–4 ל-PCPB). המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי בשיתוף עם FAPESP סיפקה תמיכה נוספת (INCT CNPq #465637/2014–0 ו FAPESP #2014/50926–0 ל- AJC).
Materials
| 96-well microplates | Kasvi | Flat bottom | |
| Activated carbon | LABSYNTH | Clean up and/or fractionation step | |
| Analytical mill | Ika LabortechniK | Model A11 Basic | |
| Blood agar plates | Laborclin | ||
| Chromatographic column C18 | Phenomenex Kinetex | 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| ELISA plate reader | Biochrom Ez | ||
| Ethanol | J. T. Baker | For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| Ethyl acetate | J. T. Baker | Fractionation step | |
| GraphPad Software | La Jolla | GraphPad Prism7 | |
| Hexane | J. T. Baker | Fractionation step | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Isopropanol | J. T. Baker | For extraction step | |
| Lyophilizer (a freeze dryer) | Savant | Modulyo | |
| Nylon Millipore | LAC | 0.22 µm x 13 mm | |
| Orbital shaker | Quimis | Model G816 M20 | |
| Polyamide solid phase extraction cartridge | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Silica gel | Merck | 40–63 μm, 60 Â | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Synth | 0,89% in water | |
| Solid phase extraction cartridges (SPE) | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Tryptone | Difco | ||
| UHPLC-DAD | Dionex | Ultimate 3000 RS | |
| Ultrasonic bath | UNIQUE | Model USC 2800 | |
| Yeast extract | Difco |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
- Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
- Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
- Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
- Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
- Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
- Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
- Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation–new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
- Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
- Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
- Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
- Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
- Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
- Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
- Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
- Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
- Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
- Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
- Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
- Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
- Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
- Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
- Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G., Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
- Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
- Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
- Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
- Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
- Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
- Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
- Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
- Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
- Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -. C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
- Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
- Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
- Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , (2015).
- Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).
