식물의 추출물과 분획에서 새로운 항균 및 항바이오필름 분자를 식별하여 치과 용 충치를 방지하기 위한 체계적인 접근법
Summary
천연 제품은 신약 및 치료제 개발을 위한 유망한 출발점을 나타냅니다. 그러나, 높은 화학 다양성으로 인해, 식물에서 새로운 치료 화합물을 찾는 것은 도전적이고 시간이 많이 소요되는 작업입니다. 우리는 식물 추출물과 분획에서 항균 및 항바이오필름 분자를 식별하는 단순화된 접근법을 설명합니다.
Abstract
천연 제품은 구조적으로 다른 물질을 제공하며 무수한 생물학적 활동을 제공합니다. 그러나, 식물에서 활성 화합물의 식별 및 격리는 복잡한 식물 매트릭스와 시간이 많이 소요되는 격리 및 식별 절차 때문에 도전적입니다. 따라서, 잠재적으로 활성 분자의 격리 및 식별을 포함하여 식물에서 천연 화합물을 선별하기 위한 단계적 접근법이 제시된다. 식물 재료의 수집을 포함한다; 원유 추출물의 준비 및 분별; 크로마토그래피 및 분광법(UHPLC-DAD-HRMS 및 NMR) 분석 및 화합물 식별을 위한 접근법; 생체 분석 (항균 및 항바이오필름 활동; 타액 펠리클 및 초기 글루칸 매트릭스에 대한 세균 “접착 강도”가 선택된 치료법으로 치료됨); 데이터 분석. 이 모델은 간단하고 재현 가능하며 여러 화합물, 농도 및 치료 단계의 고처리량 스크리닝을 일관되게 제어할 수 있습니다. 얻어진 데이터는 미생물 세포 및 생물막에 있는 특정 표적으로 분자를 모델링하는 가장 능동적인 추출물 및/또는 분수, 분자의 격리를 가진 제형을 포함하여 미래 연구 결과를 위한 기초를 제공합니다. 예를 들어, 카리오겐 생물막을 제어하는 한 가지 표적은 세포외 매트릭스의 글루칸을 합성하는 연쇄상 구균 뮤탄의 활성을 억제하는 것이다. 그 효소의 억제는 생물막 축적을 방지, 그것의 독성을 감소.
Introduction
사회에서 사용되는 의학의 초기 모델은 천연 제품 (NP)을 기반으로했다. 그 이후로, 인간은 약물1로변환 될 수있는 자연에서 새로운 화학 물질을 찾고있다. 이 검색은 윤리학적 스크리닝1,2,3에대한 기술과 방법의 지속적인 개선을 일으켰다. NPs는 대체 또는 보조 요법을 개발하는 데 유용한 광범위한 생물학적 활동과 함께 구조적으로 다양한 물질의 풍부한 공급원을 제공합니다. 그러나, 내재된 복잡한 식물 매트릭스는 활성 화합물의 격리 및 식별을 도전적이고 시간이 많이 소요되는 작업4로만든다.
NPs 기반 약물 또는 제형은 치과 충치4를포함하여 경구에 영향을 미치는 여러 조건을 예방 및/또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 만성 질환 중 하나인 치과용 충치는 미생물 대사로부터 유래된 유기산에 의한 탈염을 유발하는 치아 표면에 형성된 설탕이 풍부한 식단과 미생물 생물막(치피플라)의 상호작용으로부터 유래하며, 치료하지 않으면 치아 손실5,6로이어집니다. 다른 미생물은7, 연쇄상 구균 뮤탄은 산성, 산성 및 세포외 매트릭스 빌더이기 때문에 중요한 카리오겐 성 박테리아입니다. 이 종은기판으로 자당을 사용하는 다발성 효소 (예를 들어, 글리코실 전달효소 또는 Gtfs)를 인코딩하여 발성 결정제9인외폴리당산에 풍부한 세포외 매트릭스를 구축합니다. 또한, 곰팡이 칸디다 알비칸스는 세포 외 매트릭스7의생산을 구동 할 수 있습니다. 다양한 양식으로 투여되는 불소이기는 하지만 치과 충치방지의기초가 남아 있으며, 그 효과를 높이기 위해 보조제로 새로운 접근법이 필요합니다. 또한, 사용 가능한 플라크 방지 양식은 광범위한 스펙트럼 미생물제(예를 들어, 클로레헨시딘)11의사용을 기반으로 한다. 대안으로, NPs는 생물막을 통제하고 치과 충치를 방지하기위한 잠재적 인 치료법이다12,13.
식물에서 새로운 생리 활성 화합물의 발견에 추가 사전은 필요한 단계 또는 접근 방식을 포함: (i) 샘플링에 대 한 신뢰할 수 있는 재현 프로토콜의 사용, 식물 종종 특이 적 가변성을 표시 고려; (ii) 포괄적인 추출물및 그 각각의 분획을 작은 규모로 제조; (iii) 그들의 화학 프로파일의 특성화 및/또는 복제는 GC-MS, LC-DAD-MS 또는 NMR과 같은 다차원 데이터의 획득을 예를 들어, (iv) 생체 활성을 평가하기 위해 실행 가능한 고수익 모델의 사용; (v) 다변량 데이터 분석 또는 기타 통계 도구를 기반으로 잠재적인 새로운 조회수 선택; (vi) 표적 화합물 또는 유망한 후보자의 격리 및 정화를 수행하기 위해; 및 (vii) 격리된화합물을이용한 대응하는 생물학적 활동의 유효성검사2,14.
복제는 원유 추출물에서 알려진 화합물을 신속하게 식별하는 과정이며 이미 연구된 화합물과 새로운 화합물을 분화할 수 있습니다. 게다가, 이 프로세스는 생체 활성이 이미 특정 화합물에 대해 설명된 때 격리를 방지하고, 특히 “빈번한 타자”를 검출하는 것이 도움이됩니다. 주요 화합물 식별 또는 활동 유도 분수의 가속도에서 추출 컬렉션의 화학 프로파일링에 이르기까지 다양한 미표적 워크플로우에 사용되었습니다. 그것은 완전히 CE의 표적 화학 프로파일링 또는 대사 산물의 표적 식별에 대 한 metabolomic 연구와 통합 될 수 있습니다. 이 모든 것은 궁극적으로 격리절차1,15, 16,17전에 추출의 우선 순위를 지정하는 것으로 이어집니다.
따라서, 본 원고에서는 식물 추출물 및 분획으로부터 항균 및 항바이오막 분자를 식별하는 체계적인 접근법을 설명한다. 그것은 네 개의 종합 단계를 포함: (1) 식물 재료의 수집; (2) 원유 추출물(CE) 및 분획(CEF)의 제제, 그 다음으로 화학물질 프로파일 분석; (3) 바이오아세이스; (4) 생물학적 및 화학적 데이터분석(그림 1). 따라서, 우리는 연쇄상 구균 뮤탄및 칸디다 알비칸스(13)에대한 카카타리아 실베스트리스 추출물 및 분획의 항균 및 항바이오필름 활동을 분석하기 위해 개발된 프로토콜뿐만 아니라 식물화학적 특성화 및 데이터 분석을 위한 절차를 제시한다. 단순성을 위해, 여기에서 초점은 박테리아를 사용하여 천연 화합물을 선별하기위한 접근 방식을 입증하는 것입니다.
그림 1: 식물 추출물 및 분수에서 활성 분자를 식별하는 체계적인 접근법의 흐름 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
천연 원유 추출물과 관련된 주요 과제는 복잡한 구성과 고전적인 바이오 유도 격리 연구의 부적절성으로 구성됩니다. 이 과정은 느리지만 효과적이며 NP 연구에서 주요 연구 결과를 초래했습니다. 합리화하려면 우선 순위 지정 중심의 연구가 합리화될 필요가 있습니다. 따라서, 격리 전에 CE 및 복제의 분석을 위한 현대 화학 프로파일링 접근법의 사용은 연구된 물질을 특성화하는 것이 중요하며, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) UNESP의 화학 연구소의, 아라라쿠라 / SP에 식물 재료 제조를위한 실험실을 제공하는 것에 감사드립니다. 우리는 또한 치과 재료 및 보조동학과의 응용 미생물학 실험실, UNESP, 아라라 쿼라 / SP에 감사드립니다. 이 연구는 상파울루 연구 재단 (FAPESP #2013/07600-3 AJC)과 장학금 플러스 오버 헤드 펀드 (FAPESP #2017/07408-6 및 FAPESP #2019/23175-7 SMR; #2011/21440-3 및 #2012/21921-4PB)의 연구 보조금에 의해 지원되었습니다. FAPESP와 관련하여 국립 과학 기술 개발 위원회는 추가 지원을 제공 (INCT CNPq #465637/2014-0 및 FAPESP #2014/50926-0 AJC에).
Materials
| 96-well microplates | Kasvi | Flat bottom | |
| Activated carbon | LABSYNTH | Clean up and/or fractionation step | |
| Analytical mill | Ika LabortechniK | Model A11 Basic | |
| Blood agar plates | Laborclin | ||
| Chromatographic column C18 | Phenomenex Kinetex | 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| ELISA plate reader | Biochrom Ez | ||
| Ethanol | J. T. Baker | For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| Ethyl acetate | J. T. Baker | Fractionation step | |
| GraphPad Software | La Jolla | GraphPad Prism7 | |
| Hexane | J. T. Baker | Fractionation step | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Isopropanol | J. T. Baker | For extraction step | |
| Lyophilizer (a freeze dryer) | Savant | Modulyo | |
| Nylon Millipore | LAC | 0.22 µm x 13 mm | |
| Orbital shaker | Quimis | Model G816 M20 | |
| Polyamide solid phase extraction cartridge | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Silica gel | Merck | 40–63 μm, 60 Â | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Synth | 0,89% in water | |
| Solid phase extraction cartridges (SPE) | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Tryptone | Difco | ||
| UHPLC-DAD | Dionex | Ultimate 3000 RS | |
| Ultrasonic bath | UNIQUE | Model USC 2800 | |
| Yeast extract | Difco |
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