Systematisk tilnærming til å identifisere nye antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planters ekstrakter og fraksjoner for å forhindre tannkaries

Summary

Naturlige produkter representerer lovende utgangspunkt for utvikling av nye legemidler og terapeutiske midler. Men på grunn av det høye kjemiske mangfoldet er det utfordrende og tidkrevende å finne nye terapeutiske forbindelser fra planter. Vi beskriver en forenklet tilnærming for å identifisere antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraksjoner.

Abstract

Naturlige produkter gir strukturelt forskjellige stoffer, med en myriade av biologiske aktiviteter. Identifisering og isolering av aktive forbindelser fra planter er imidlertid utfordrende på grunn av den komplekse plantematrisen og tidkrevende isolasjons- og identifikasjonsprosedyrer. Derfor presenteres en trinnvis tilnærming for screening av naturlige forbindelser fra planter, inkludert isolasjon og identifisering av potensielt aktive molekyler. Det inkluderer innsamling av plantematerialet; forberedelse og fraksjonering av råoljeekstrakter; kromatografi og spektrometri (UHPLC-DAD-HRMS og NMR) tilnærminger for analyse og forbindelser identifikasjon; bioanalyser (antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter; bakteriell “vedheftsstyrke” til spyttpellet og innledende glukanmatrise behandlet med utvalgte behandlinger); og dataanalyse. Modellen er enkel, reproduserbar, og tillater høy gjennomstrømning screening av flere forbindelser, konsentrasjoner, og behandlingstrinn kan konsekvent kontrolleres. Dataene som er innhentet, danner grunnlaget for fremtidige studier, inkludert formuleringer med de mest aktive ekstraktene og/eller brøkene, isolering av molekyler, modellering av molekyler til spesifikke mål i mikrobielle celler og biofilmer. For eksempel er et mål å kontrollere karogen biofilm å hemme aktiviteten til Streptococcus mutans glukotransferaser som syntetiserer den ekstracellulære matrisens glukaner. Hemming av disse enzymene forhindrer biofilmoppbygging, noe som reduserer dens virulens.

Introduction

De tidligste modellene av medisin som brukes i samfunn var basert på naturlige produkter (NPer). Siden da har mennesker lett etter nye kjemikalier i naturen som kan forvandles til narkotika¹. Dette søket forårsaket en kontinuerlig forbedring av teknologier og metoder for etnobotanisk screening^1,2,3. NPs tilbyr en rik kilde til strukturelt varierte stoffer, med et bredt spekter av biologiske aktiviteter som er nyttige for å utvikle alternative eller adjuvante terapier. Den iboende komplekse plantematrisen gjør imidlertid isolasjon og identifisering av de aktive forbindelsene til en utfordrende og tidkrevende oppgave⁴.

NPs-baserte legemidler eller formuleringer kan brukes til å forebygge og/eller behandle flere tilstander som påvirker orale, inkludert^{tannkaries 4}. Dental karies, en av de mest utbredte kroniske sykdommene globalt, stammer fra samspillet mellom sukkerrikt kosthold og mikrobielle biofilmer (tannplakk) dannet på tannoverflaten som fører til demineralisering forårsaket av organiske syrer avledet fra mikrobiell metabolisme, og hvis ikke behandlet, fører til tanntap^5,6. Selv om andre mikroorganismer kan være forbundet^7, er Streptococcus mutans en kritisk karogen bakterie fordi den er surogen, sur og en ekstracellulær matrisebygger. Denne arten koder flere eksoenzymer (f.eks. glykosyltransferaser eller Gtfs) som bruker sukrose som substrat⁸ for å bygge den ekstracellulære matrisen rik på eksopolysakkarider, som er en virulensdeterminant⁹. Også sopp Candida albicans kan drive opp produksjonen av den ekstracellulære^{matrisen 7}. Riktignok fluor, administrert i ulike modaliteter, er fortsatt grunnlaget for å forebygge tannkaries¹⁰, nye tilnærminger er nødvendig som adjuvans for å øke effektiviteten. I tillegg er tilgjengelige anti-plakk modaliteter basert på bruk av bredspektrede mikrobicider (f.eks klorhexidin)¹¹. Som et alternativ er NPs potensielle terapier for å kontrollere biofilmer og forebygge tannkaries^12,13.

Det videre fremskrittet i oppdagelsen av nye bioaktive forbindelser fra planter inkluderer nødvendige trinn eller tilnærminger som: (i) bruk av pålitelige og reproduserbare protokoller for prøvetaking, med tanke på at planter ofte viser intraspesifikk variasjon; (ii) utarbeidelsen av omfattende ekstrakter og deres respektive fraksjoner i liten skala; (iii) karakterisering og/eller deplisering av deres kjemiske profiler trodde oppkjøpet av flerdimensjonale data som GC-MS, LC-DAD-MS eller NMR, for eksempel; (iv) bruk av levedyktige og høykapasitetsmodeller for å vurdere bioaktivitet; (v) valg av potensielle nye treff basert på multivariatdataanalyse eller andre statistiske verktøy; (vi) for å utføre isolasjon og rensing av målrettede forbindelser eller lovende kandidater; og (vii) valideringen av de korresponderte biologiske aktivitetene ved hjelp av de isolerte^{forbindelsene 2,14}.

Dereplisering er prosessen med raskt å identifisere kjente forbindelser i råoljeekstrakt og tillater differensiering av nye forbindelser fra de som allerede er studert. Dessuten forhindrer denne prosessen isolasjon når bioaktivitet allerede er beskrevet for visse forbindelser, og det er spesielt nyttig å oppdage “hyppige hitters”. Den har blitt brukt i forskjellige untargeted arbeidsflyter som spenner fra store sammensatte identifikasjon eller akselerasjon av aktivitetsstyrt fraksjonering opp til kjemisk profilering av samlinger av ekstrakter. Det kan integreres fullt ut med metabolomiske studier for umålrettet kjemisk profilering av CE eller målrettet identifisering av metabolitter. Alt dette fører til slutt til å prioritere utdrag før isolasjonsprosedyrene^1,15,16,17.

Derfor beskriver vi i det nåværende manuskriptet en systematisk tilnærming for å identifisere antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraksjoner. Det inkluderer fire tverrfaglige trinn: (1) samling av plantemateriale; (2) fremstilling av råoljeekstrakter (CE) og fraksjoner (CEF), etterfulgt av deres kjemiske profilanalyse; (3) bioanalyse; og (4) biologiske og kjemiske dataanalyser (figur 1). Dermed presenterer vi protokollen utviklet for å analysere antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter av Casearia sylvestris ekstrakter og fraksjoner mot Streptococcus mutans og Candida albicans¹³, samt prosedyrene for fytokjemisk karakterisering og dataanalyse. For enkelhets skyld er fokuset her å demonstrere tilnærmingen for screening av naturlige forbindelser ved hjelp av bakterien.

Figur 1: Flytkart over den systematiske tilnærmingen for å identifisere aktive molekyler fra planteekstrakter og fraksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Innsamling av plantemateriale Plantemateriale Registrer tilgangen til plantematerialet på elektroniske plattformer som regulerer tilgangen til genetisk arv i landet der samlingen vil finne sted. For eksempel, i Brasil, registrer deg hos Det nasjonale systemet for styring av genetisk arv og tilhørende tradisjonell kunnskap – SisGen (https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx). Samle prøver av plantematerialet av interesse (f.eks blader, stengler, røtter, blomster, frukt). Registrer om mat…

Representative Results

Vi gir et eksempel på å bruke en systematisk tilnærming til å screene den biologiske aktiviteten til planteekstrakter og fraksjoner for å identifisere potensielt aktive molekyler for mulige nye anti-karies terapier: antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter av Casearia sylvestris ekstrakter fra forskjellige brasilianske biomer mot Streptococcus mutans og Candida albicans13. BakgrunnKomplekse interaksjoner mellom spesi…

Discussion

De viktigste utfordringene knyttet til arbeidet med naturlige råoljeekstrakter utgjør deres komplekse sammensetning og utilstrekkelighetene til klassiske biostyrte isolasjonsstudier. Selv om denne prosessen er treg, er den effektiv og har ført til store funn i NP-forskning. For å rasjonalisere er det nødvendig med prioriteringsdrevne studier for å rasjonalisere. Dermed er bruk av moderne kjemisk profilering tilnærminger for analyse av CE og duplisering før isolasjon viktig å karakterisere det studerte materialet…

Materials

96-well microplates	Kasvi	Flat bottom
Activated carbon	LABSYNTH	Clean up and/or fractionation step
Analytical mill	Ika LabortechniK	Model A11 Basic
Blood agar plates	Laborclin
Chromatographic column C18	Phenomenex Kinetex	150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
ELISA plate reader	Biochrom Ez
Ethanol	J. T. Baker	For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
Ethyl acetate	J. T. Baker	Fractionation step
GraphPad Software	La Jolla	GraphPad Prism7
Hexane	J. T. Baker	Fractionation step
Incubator	Thermo Scientific
Isopropanol	J. T. Baker	For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer)	Savant	Modulyo
Nylon Millipore	LAC	0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker	Quimis	Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Silica gel	Merck	40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl)	Synth	0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE)	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Tryptone	Difco
UHPLC-DAD	Dionex	Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath	UNIQUE	Model USC 2800
Yeast extract	Difco