Enfoque sistemático para identificar nuevas moléculas antimicrobianas y antibiócidas de extractos y fracciones de plantas para prevenir caries dentales
Summary
Los productos naturales representan prometedores puntos de partida para el desarrollo de nuevos fármacos y agentes terapéuticos. Sin embargo, debido a la alta diversidad química, encontrar nuevos compuestos terapéuticos de las plantas es una tarea difícil y que consume mucho tiempo. Describimos un enfoque simplificado para identificar moléculas antimicrobianas y antibiócidas a partir de extractos y fracciones vegetales.
Abstract
Los productos naturales proporcionan sustancias estructuralmente diferentes, con una miríada de actividades biológicas. Sin embargo, la identificación y el aislamiento de compuestos activos de las plantas son difíciles debido a la compleja matriz vegetal y los procedimientos de aislamiento e identificación que consumen mucho tiempo. Por lo tanto, se presenta un enfoque escalonado para la detección de compuestos naturales de las plantas, incluyendo el aislamiento y la identificación de moléculas potencialmente activas. Incluye la recogida del material vegetal; preparación y fraccionamiento de extractos crudos; enfoques de cromatografía y espectrometría (UHPLC-DAD-HRMS y NMR) para la identificación de análisis y compuestos; bioensayos (actividades antimicrobianas y antibióticas; “fuerza de adhesión” bacteriana al pellicle salival y matriz glucana inicial tratada con tratamientos seleccionados); y análisis de datos. El modelo es simple, reproducible y permite la detección de alto rendimiento de múltiples compuestos, concentraciones y pasos de tratamiento se pueden controlar constantemente. Los datos obtenidos proporcionan la base para futuros estudios, incluyendo formulaciones con los extractos y/o fracciones más activos, aislamiento de moléculas, modelado de moléculas a objetivos específicos en células microbianas y biofilms. Por ejemplo, un objetivo para controlar el biofilm cariogénico es inhibir la actividad de Streptococcus mutans glucosyltransferases que sintetizan los glucanos de la matriz extracelular. La inhibición de esas enzimas impide la acumulación de biofilm, disminuyendo su virulencia.
Introduction
Los primeros modelos de medicina utilizados en las sociedades se basaron en productos naturales (NPs). Desde entonces, los seres humanos han estado buscando nuevos productos químicos en la naturaleza que pueden transformarse en drogas1. Esta búsqueda causó una mejora continua de tecnologías y métodos para la detección etnobotánica1,2,3. Los NPs ofrecen una rica fuente de sustancias estructuralmente diversas, con una amplia gama de actividades biológicas útiles para el desarrollo de terapias alternativas o adyuvantes. Sin embargo, la matriz vegetal compleja inherente hace que el aislamiento y la identificación de los compuestos activos sea una tarea desafiante y que consume mucho tiempo4.
Los medicamentos o formulaciones basados en NPs se pueden utilizar para prevenir y/o tratar varias afecciones que afectan oralmente, incluidos los caries dentales4. Los caries dentales, una de las enfermedades crónicas más prevalentes a nivel mundial, derivan de la interacción de la dieta rica en azúcar y biofilms microbianos (placa dental) formados en la superficie dental que conduce a la desmineralización causada por ácidos orgánicos derivados del metabolismo microbiano, y si no se tratan, conduce a la pérdida de dientes5,6. Aunque otros microorganismos pueden estar asociados7, Streptococcus mutans es una bacteria cariogénica crítica porque es acidogénico, acidurico, y un constructor de matriz extracelular. Esta especie codifica múltiples exoenzimas (por ejemplo, glicosiltransferasas o Gtfs) que utilizan sacarosa como sustrato8 para construir la matriz extracelular rica en exopolísacáridos, que son un determinante de virulencia9. Además, el hongo Candida albicans puede impulsar la producción de esa matriz extracelular7. Aunque el flúor, administrado en diversas modalidades, sigue siendo la base para prevenir caries dentales10,se necesitan nuevos enfoques como adyuvantes para aumentar su eficacia. Además, las modalidades anti-placa disponibles se basan en el uso de agentes microbicidas de amplio espectro (por ejemplo, clorhexidina)11. Como alternativa, los NPs son terapias potenciales para controlar biofilms y prevenir caries dentales12,13.
El avance adicional en el descubrimiento de nuevos compuestos bioactivos de las plantas incluye pasos o enfoques necesarios tales como: i) el uso de protocolos fiables y reproducibles para el muestreo, teniendo en cuenta que las plantas a menudo muestran variabilidad intraespecífica; (ii) la preparación de extractos completos y sus respectivas fracciones a pequeña escala; (iii) la caracterización y/o desreplicación de sus perfiles químicos pensó en la adquisición de datos multidimensionales como GC-MS, LC-DAD-MS o NMR, por ejemplo; (iv) el uso de modelos viables y de alto rendimiento para evaluar la bioactividad; (v) la selección de nuevos éxitos potenciales basados en análisis de datos multivariantes u otras herramientas estadísticas; (vi) realizar el aislamiento y purificación de los compuestos objetivo o candidatos prometedores; y vii) la validación de las actividades biológicas correspondidas utilizando los compuestos aislados2,14.
La desreplicación es el proceso de identificación rápida de compuestos conocidos en extracto crudo y permite diferenciar compuestos novedosos de los que ya han sido estudiados. Además, este proceso evita el aislamiento cuando ya se ha descrito la bioactividad para ciertos compuestos, y es particularmente útil detectar “bateadores frecuentes”. Se ha utilizado en diferentes flujos de trabajo no dirigidos que van desde la identificación de compuestos principales o la aceleración del fraccionamiento guiado por actividad hasta la elaboración de perfiles químicos de colecciones de extractos. Se puede integrar completamente con estudios metabolómicos para la elaboración de perfiles químicos no dirigidos de CE o la identificación específica de metabolitos. Todo esto conduce en última instancia a priorizar los extractos antes de los procedimientos de aislamiento1,15,16,17.
Por lo tanto, en el presente manuscrito, describimos un enfoque sistemático para identificar moléculas antimicrobianas y antibiócidas a partir de extractos y fracciones vegetales. Incluye cuatro pasos multidisciplinarios: (1) recolección de material vegetal; 2) preparación de extractos crudos (CE) y fracciones (CEF), seguidos de su análisis de perfil químico; 3) bioensayos; y (4) análisis biológicos y químicos de datos (Figura 1). Así, presentamos el protocolo desarrollado para analizar las actividades antimicrobianas y antibióquidas de extractos y fracciones de Casearia sylvestris contra Streptococcus mutans y Candida albicans13,así como los procedimientos para la caracterización fitoquímica y el análisis de datos. Para simplificar, el enfoque aquí es demostrar el enfoque para la detección de compuestos naturales utilizando la bacteria.
Figura 1: Diagrama de flujo del enfoque sistemático para identificar moléculas activas de extractos y fracciones de plantas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los principales desafíos relacionados con el trabajo con extractos de crudo natural comprenden su composición compleja y las insuficiencias de los estudios clásicos de aislamiento bioguiado. Aunque este proceso es lento, es eficaz y ha llevado a importantes hallazgos en la investigación np. Para racionalizar, se necesitan estudios basados en la priorización para racionalizar. Por lo tanto, el uso de enfoques modernos de elaboración de perfiles químicos para el análisis del CE y la desreplicación antes del aislam…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expresamos nuestro agradecimiento al Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) del Instituto de Química de la UNESP, Araraquara/SP por proporcionar los laboratorios para la preparación de material vegetal. También agradecemos al Laboratorio de Microbiología Aplicada del Departamento de Materiales y Prostodoncia Dental, UNESP, Araraquara/SP. Esta investigación fue apoyada por una beca de investigación de la São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600–3 a AJC) y becas más fondos generales (FAPESP #2017/07408-6 y FAPESP #2019/23175-7 a SMR; #2011/21440–3 y #2012/21921–4 a PCPB). El Consejo Nacional para el Desarrollo Científico y Tecnológico en asociación con la FAPESP brindó apoyo adicional (INCT CNPq #465637/2014-0 y FAPESP #2014/50926-0 a AJC).
Materials
| 96-well microplates | Kasvi | Flat bottom | |
| Activated carbon | LABSYNTH | Clean up and/or fractionation step | |
| Analytical mill | Ika LabortechniK | Model A11 Basic | |
| Blood agar plates | Laborclin | ||
| Chromatographic column C18 | Phenomenex Kinetex | 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| ELISA plate reader | Biochrom Ez | ||
| Ethanol | J. T. Baker | For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| Ethyl acetate | J. T. Baker | Fractionation step | |
| GraphPad Software | La Jolla | GraphPad Prism7 | |
| Hexane | J. T. Baker | Fractionation step | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Isopropanol | J. T. Baker | For extraction step | |
| Lyophilizer (a freeze dryer) | Savant | Modulyo | |
| Nylon Millipore | LAC | 0.22 µm x 13 mm | |
| Orbital shaker | Quimis | Model G816 M20 | |
| Polyamide solid phase extraction cartridge | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Silica gel | Merck | 40–63 μm, 60 Â | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Synth | 0,89% in water | |
| Solid phase extraction cartridges (SPE) | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Tryptone | Difco | ||
| UHPLC-DAD | Dionex | Ultimate 3000 RS | |
| Ultrasonic bath | UNIQUE | Model USC 2800 | |
| Yeast extract | Difco |
References
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