Systematisk tilgang til identificering af nye antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planternes ekstrakter og fraktioner for at forhindre caries

Summary

Naturlige produkter udgør lovende udgangspunkter for udviklingen af nye lægemidler og terapeutiske midler. Men på grund af den høje kemiske mangfoldighed er det en udfordrende og tidskrævende opgave at finde nye terapeutiske forbindelser fra planter. Vi beskriver en forenklet tilgang til identifikation af antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraktioner.

Abstract

Naturlige produkter giver strukturelt forskellige stoffer med et utal af biologiske aktiviteter. Identifikation og isolering af aktive forbindelser fra planter er imidlertid udfordrende på grund af den komplekse plantematrix og tidskrævende isolations- og identifikationsprocedurer. Derfor præsenteres en trinvis tilgang til screening af naturlige forbindelser fra planter, herunder isolering og identifikation af potentielt aktive molekyler. Det omfatter indsamling af plantematerialet; tilberedning og fraktionering af råekstrakter; kromatografi og spektrometri (UHPLC-DAD-HRMS og NMR) metoder til analyse og identifikation af forbindelser bioassays (antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter; bakteriel “vedhæftningsstyrke” til spyt pellicle og indledende glucanmatrix behandlet med udvalgte behandlinger) og dataanalyse. Modellen er enkel, reproducerbar og giver mulighed for screening med høj gennemløb af flere forbindelser, koncentrationer og behandlingstrin kan kontrolleres konsekvent. De opnåede data danner grundlag for fremtidige undersøgelser, herunder formuleringer med de mest aktive ekstrakter og/eller fraktioner, isolering af molekyler, modellering af molekyler til specifikke mål i mikrobielle celler og biofilm. For eksempel er et mål at kontrollere cariogen biofilm at hæmme aktiviteten af Streptococcus mutans glucosyltransferaser, der syntetiserer den ekstracellulære matrix ‘glucaner. Hæmning af disse enzymer forhindrer ophobning af biofilm, hvilket reducerer dens virulens.

Introduction

De tidligste modeller af medicin, der anvendes i samfund, var baseret på naturlige produkter (NPs). Siden da har mennesker søgt efter nye kemikalier i naturen, der kan omdannes til stoffer¹. Denne søgning medførte en løbende forbedring af teknologier og metoder til ethnobotanical screening^1,2,3. NPs tilbyder en rig kilde til strukturelt forskellige stoffer, med en bred vifte af biologiske aktiviteter nyttige til udvikling af alternative eller adjuvans behandlinger. Den iboende komplekse plantematrix gør imidlertid isolering og identifikation af de aktive forbindelser til en udfordrende og tidskrævende opgave⁴.

NPs-baserede lægemidler eller formuleringer kan bruges til at forebygge og/eller behandle flere tilstande, der påvirker orale, herunder caries⁴. Caries, en af de mest udbredte kroniske sygdomme globalt, stammer fra samspillet mellem sukkerrig kost og mikrobielle biofilm (plak) dannet på tandoverfladen, der fører til demineralisering forårsaget af organiske syrer afledt af mikrobiel metabolisme, og hvis de ikke behandles, fører til tandtab^5,6. Selv om andre mikroorganismer kan være forbundet⁷, Streptococcus mutans er en kritisk cariogen bakterie, fordi det er acidogen, aciduric, og en ekstracellulær matrix builder. Denne art koder flere exoenzymer (f.eks. glykosyltransferaser eller GTF’er), der bruger saccharose som substrat⁸ til at opbygge den ekstracellulære matrix, der er rig på exopolysaccharider, som er en virulensdeterminant⁹. Svampen Candida albicans kan også øge produktionen af den ekstracellulære matrix⁷. Selv om fluor, administreret i forskellige modaliteter, fortsat er grundlaget for at forebygge caries¹⁰, nye tilgange er nødvendige som adjuvanser for at øge dens effektivitet. Desuden er de tilgængelige antiplak-modaliteter baseret på brugen af bredspektret mikrobicidale midler (f.eks. chlorhexidin)¹¹. Som et alternativ, NPs er potentielle behandlingsformer til kontrol af biofilm og forebyggelse af caries^12,13.

Det yderligere fremskridt med opdagelsen af nye bioaktive forbindelser fra planter omfatter nødvendige skridt eller fremgangsmåder såsom: i) anvendelse af pålidelige og reproducerbare protokoller til prøveudtagning, idet planterne ofte udviser intraspecifik variation; ii) fremstilling af samlede ekstrakter og deres respektive fraktioner i lille målestok iii) karakteriseringen og/eller dereplicationen af deres kemiske profiler mente f.eks., at der var anskaffelse af flerdimensionale data såsom GC-MS, LC-DAD-MS eller NMR iv) anvendelse af levedygtige modeller med højt udbytte til vurdering af bioaktivitet v) udvælgelse af potentielle nye hits baseret på flerdimensional dataanalyse eller andre statistiske værktøjer vi) at foretage isolering og rensning af de målrettede forbindelser eller lovende kandidater og vii) validering af de tilsvarende biologiske aktiviteter ved hjælp af de isolerede forbindelser^2,14.

Dereplication er processen med hurtigt at identificere kendte forbindelser i rå ekstrakt og giver mulighed for at skelne nye forbindelser fra dem, der allerede er blevet undersøgt. Desuden forhindrer denne proces isolation, når bioaktivitet allerede er beskrevet for visse forbindelser, og det er især nyttigt at opdage “hyppige hitters”. Det har været brugt i forskellige ikke-målrettede arbejdsgange lige fra større sammensatte identifikation eller acceleration af aktivitetsstyret fraktionering op til den kemiske profilering af samlinger af ekstrakter. Det kan integreres fuldt ud med metabolomiske undersøgelser med henblik på ikke-målrettet kemisk profilering af CE eller målrettet identifikation af metabolitter. Alt dette fører i sidste ende til at prioritere uddrag før isolationsprocedurerne^1,15,16,17.

Derfor beskriver vi i dette manuskript en systematisk tilgang til identifikation af antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraktioner. Det omfatter fire tværfaglige trin: 1) indsamling af plantemateriale; 2) fremstilling af råekstrakter (CE) og fraktioner (CEF) efterfulgt af deres kemiske profilanalyse 3) bioassays og 4) analyser af biologiske og kemiske data (figur 1). Således præsenterer vi den protokol, der er udviklet til at analysere casearia sylvestrisekstrakternes og fraktionernes antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter mod Streptococcus mutans og Candida albicans¹³, samt procedurerne for den fytokemiske karakterisering og dataanalyse. For nemheds skyld er fokus her at demonstrere tilgangen til screening af naturlige forbindelser ved hjælp af bakterien.

Figur 1: Rutediagram over den systematiske metode til identifikation af aktive molekyler fra planteekstrakter og fraktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Indsamling af plantemateriale Plantemateriale Registrer adgangen til plantematerialet på elektroniske platforme, der regulerer adgangen til genetisk arv i det land, hvor samlingen skal finde sted. For eksempel i Brasilien skal du registrere dig hos det nationale system til forvaltning af genetisk arv og tilknyttet traditionel viden – SisGen (websted https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx). Indsamle prøver af plantemateriale af interesse (f.eks blade, stilke, rødder, blomster, frugter)…

Representative Results

Vi giver et eksempel på at bruge en systematisk tilgang til at screene den biologiske aktivitet af planteekstrakter og fraktioner for at identificere potentielt aktive molekyler til mulige nye anti-caries-behandlinger: antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter i Casearia sylvestris-ekstrakter fra forskellige brasilianske biomer mod Streptococcus mutans og Candida albicans13. BaggrundKomplekse interaktioner mellem specifik…

Discussion

De største udfordringer i forbindelse med arbejdet med naturlige råekstrakter omfatter deres komplekse sammensætning og utilstrækkeligheden af klassiske biostyrede isolationsstudier. Selv om denne proces er langsom, er den effektiv og har ført til store resultater inden for NP-forskning. For at rationalisere er prioriteringsdrevne undersøgelser nødvendige for at rationalisere. Således er brugen af moderne kemiske profileringsmetoder til analyse af CE og dereplication før isolation vigtig for at karakterisere det…

Materials

96-well microplates	Kasvi	Flat bottom
Activated carbon	LABSYNTH	Clean up and/or fractionation step
Analytical mill	Ika LabortechniK	Model A11 Basic
Blood agar plates	Laborclin
Chromatographic column C18	Phenomenex Kinetex	150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
ELISA plate reader	Biochrom Ez
Ethanol	J. T. Baker	For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol	Sigma-Aldrich	Vehicle solution
Ethyl acetate	J. T. Baker	Fractionation step
GraphPad Software	La Jolla	GraphPad Prism7
Hexane	J. T. Baker	Fractionation step
Incubator	Thermo Scientific
Isopropanol	J. T. Baker	For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer)	Savant	Modulyo
Nylon Millipore	LAC	0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker	Quimis	Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Silica gel	Merck	40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl)	Synth	0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE)	Macherey-Nagel	Clean up and/or fractionation step
Tryptone	Difco
UHPLC-DAD	Dionex	Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath	UNIQUE	Model USC 2800
Yeast extract	Difco