Génération de neurones humains et d’oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes pour la modélisation des interactions neurone-oligodendrocytes
Summary
Les interactions neurone-gliale dans la neurodégénérescence ne sont pas bien comprises en raison d’outils et de méthodes inadéquats. Ici, nous décrivons des protocoles optimisés pour obtenir des neurones induits, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines et fournissons des exemples des valeurs de ces méthodes dans la compréhension des contributions spécifiques au type cellulaire dans la maladie d’Alzheimer.
Abstract
Dans la maladie d’Alzheimer (MA) et d’autres troubles neurodégénératifs, l’insuffisance oligodendrogliale est une caractéristique pathologique précoce commune, mais la façon dont elle contribue au développement et à la progression de la maladie, en particulier dans la matière grise du cerveau, reste largement inconnue. Le dysfonctionnement des cellules de la lignée oligodendrocytaire est caractérisé par des déficiences dans la myélinisation et une altération de l’auto-renouvellement des cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC). Ces deux défauts sont causés au moins en partie par la perturbation des interactions entre les neurones et les oligodendrocytes tout au long de l’accumulation de la pathologie. Les OPC donnent naissance à des oligodendrocytes myélinisants au cours du développement du SNC. Dans le cortex cérébral mature, les OPC sont les principales cellules prolifératives (comprenant ~ 5% du total des cellules cérébrales) et contrôlent la formation de nouvelles myélines d’une manière dépendante de l’activité neuronale. De telles communications neurone-oligodendrocyte sont significativement sous-étudiées, en particulier dans le contexte de maladies neurodégénératives telles que la MA, en raison du manque d’outils appropriés. Au cours des dernières années, notre groupe et d’autres ont fait des progrès significatifs pour améliorer les protocoles actuellement disponibles pour générer des neurones fonctionnels et des oligodendrocytes individuellement à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Dans ce manuscrit, nous décrivons nos procédures optimisées, y compris la mise en place d’un système de co-culture pour modéliser les connexions neurone-oligodendrocytes. Nos résultats illustratifs suggèrent une contribution inattendue des OPC / oligodendrocytes à l’amylose cérébrale et à l’intégrité des synapses et soulignent l’utilité de cette méthodologie pour la recherche sur la MA. Cette approche réductionniste est un outil puissant pour disséquer les interactions hétérocellulaires spécifiques à partir de la complexité inhérente à l’intérieur du cerveau. Les protocoles que nous décrivons ici devraient faciliter les études futures sur les défauts oligodendrogliales dans la pathogenèse de la neurodégénérescence.
Introduction
Les cellules de la lignée oligodendrocytes, y compris les cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC), les oligodendrocytes myélinisants et les types transitoires intermédiaires, constituent un groupe important de cellules cérébrales humaines1 qui participent activement à de nombreuses fonctions essentielles au bon fonctionnement et au maintien de notre système nerveux central tout au long du développement neuronal et du vieillissement 2,3,4 . Alors que les oligodendrocytes sont bien connus pour produire de la myéline pour faciliter la transmission de l’activité neuronale et soutenir la santé axonale dans la substance blanche, les OPC sont abondants (~5%) dans la matière grise où la myélinisation est rare et remplissent des fonctions de signalisation dépendantes de l’activité pour régir le comportement d’apprentissage et la formation de la mémoire 5,6,7,8 . Le fonctionnement et le dysfonctionnement des cellules oligodendrogliales dans la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer (MA) et d’autres affections neurodégénératives associées à l’âge ont été sous-étudiés9. Les insuffisances d’un système modèle approprié et les lacunes dans les connaissances générales pour guider une voie expérimentale sont les principales raisons de cet écart.
À la lumière des dernières percées dans la dérivation de cellules cérébrales humaines à partir de cellules souches pluripotentes, y compris les cellules souches embryonnaires (SE) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS), de tels modèles cellulaires, associés à des outils modernes d’édition de gènes, sont apparus comme des outils robustes pour gérer le lien complexe des interactions cellulaires dans le cerveau et sont capables de démontrer des manifestations de maladies spécifiques à l’homme10, 11. Étant donné que les types individuels de cellules cérébrales peuvent présenter des effets distincts et même contradictoires face aux mêmes conditions favorisant la MA12,13, cette méthodologie de cellules souches offre de manière unique des informations spécifiques au type de cellules qui ont été précédemment manquées à l’aide de modèles établis in vivo ou in vitro qui ne fournissent que des lectures agrégées à partir de collections de types de cellules cérébrales. Au cours de la dernière décennie, un bon nombre de protocoles fiables ont été développés pour générer des neurones humains à partir de la transdifférenciation des cellules ES/iPS ou de la conversion directe à partir d’autres types de cellules différenciées en phase terminale (p. ex. fibroblastes)14,15. En particulier, l’application de facteurs de transcription neurogènes clés (p. ex. neurogénine 2, Ngn2)16 aux cellules souches pluripotentes humaines peut générer une population homogène de types de cellules neuronales bien caractérisées pour des cultures pures sans qu’il soit nécessaire de coculturer avec des cellules gliales12,17,18. Pour les oligodendrocytes humains induits, il existe quelques protocoles publiés qui peuvent générer des cellules fonctionnelles ressemblant fortement à leurs homologues primaires, avec un large éventail d’efficacité et de demande en temps et en ressources 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . À ce jour, aucun de ces protocoles n’a été appliqué pour étudier comment les cellules oligodendrogliales répondent à la pathogenèse de la MA et l’affectent.
Ici, nous décrivons nos protocoles améliorés pour les cultures uniques et mixtes de neurones induits humains (iNs) et d’OPC / oligodendrocytes (iOPC / iOLs). Le protocole iN décrit ici est basé sur l’approche Ngn2largement utilisée 16, et a la particularité supplémentaire d’être exempt de glie. Les iNs résultants sont homogènes et ressemblent fortement aux neurones excitateurs de la couche corticale 2/3, avec une morphologie pyramidale caractéristique, un modèle d’expression génique et des caractéristiques électrophysiologiques17,18 (Figure 1). Pour surmonter certains des obstacles fondamentaux à la différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes, nous avons développé une méthode simple et efficace de prétraitement à faible dose de diméthylsulfoxyde (DMSO)29,30, et rapporté une propension accrue des cellules ES/iPS humaines à se différencier en iOPC et iOLs31, sur la base d’un protocole largement adapté par Douvaras et Fossati 32 . Nous avons encore simplifié le protocole et incorporé un composé robuste favorisant la différenciation, la clémastine 7,33,34, pour accélérer le processus de maturation oligodendrogiale. En conséquence (Figure 2), les OPCi peuvent être générés en 2 semaines (~95% positifs pour le marqueur O4) et les iOLs en quatre semaines (exprimant les marqueurs matures MBP et PLP1). Fait intéressant, nous avons constaté que les CPi seuls sécrètent une quantité remarquable de β amyloïde (Aβ), ce qui correspond aux données transcriptomiques indépendantes montrant l’expression abondante de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) et de la protéase de traitement β-sécrétase (BACE1) dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire35,36. De plus, notre système de co-culture iN-iOPC favorise l’engainage des axones par des processus iOL MBP-positifs et fournit un soutien significatif pour la formation de synapses (Figure 3). Ainsi, les protocoles que nous avons détaillés ci-dessous présentent des avantages techniques et biologiques par rapport aux méthodes de co-culture neurone-oligodendroglie précédemment cataloguées, et sont prometteurs pour une meilleure modélisation de la neurodégénérescence dans la MA.
Protocol
Representative Results
Discussion
En plus du soutien physique et métabolique pour stabiliser les structures synaptiques et faciliter la conduction du signal salatoire par myélinisation, les cellules de la lignée oligodendrocytaire peuvent façonner le schéma d’activité neuronale via des diaphonies rapides et dynamiques avec les neurones 5,6,7. Alors que dans la pathologie de la MA, les réponses oligodendrogliales étaient initialement considérées comme…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health (R00 AG054616 à Y.A.H. et T32 GM136566 à K.C.), de la Stanford University School of Medicine et d’une bourse Siebel (attribuée à S.C.). Y.A.H. est professeur translationnel GFL du Center for Translational Neuroscience du Brown Institute for Translational Sciences.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
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