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Neurosciences

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61778
, , , , , , ,
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry,Brown University, 2Department of Neurology,The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,Stanford University School of Medicine, 4Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine,Stanford University School of Medicine, 5Department of Neurology,Warren Alpert Medical School of Brown University, 6Center for Translational Neuroscience, Robert J. and Nancy D. Carney Institute for Brain Science and Brown Institute for Translational Science,Brown University

Summary

Die Neuron-Glia-Interaktionen bei der Neurodegeneration sind aufgrund unzureichender Werkzeuge und Methoden nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Gewinnung induzierter Neuronen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Oligodendrozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen und geben Beispiele für die Werte dieser Methoden zum Verständnis zelltypspezifischer Beiträge bei der Alzheimer-Krankheit.

Abstract

Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) und anderen neurodegenerativen Erkrankungen ist das oligodendrogliale Versagen ein häufiges frühes pathologisches Merkmal, aber wie es zur Entwicklung und Progression der Krankheit beiträgt, insbesondere in der grauen Substanz des Gehirns, bleibt weitgehend unbekannt. Die Dysfunktion von Oligodendrozyten-Linienzellen ist gekennzeichnet durch Mängel in der Myelinisierung und eine gestörte Selbsterneuerung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs). Diese beiden Defekte werden zumindest teilweise durch die Störung der Interaktionen zwischen Neuronen und Oligodendrozyten während des Aufbaus der Pathologie verursacht. OPCs führen während der ZNS-Entwicklung zu myelinisierenden Oligodendrozyten. In der reifen Hirnrinde sind OPCs die wichtigsten proliferativen Zellen (die ~5% der gesamten Gehirnzellen ausmachen) und kontrollieren die Neubildung von Myelin in Abhängigkeit von der neuronalen Aktivität. Solche Neuron-zu-Oligodendrozyten-Kommunikationen sind insbesondere im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie AD aufgrund des Mangels an geeigneten Werkzeugen deutlich unteruntersucht. In den letzten Jahren haben unsere Gruppe und andere bedeutende Fortschritte bei der Verbesserung der derzeit verfügbaren Protokolle zur individuellen Erzeugung funktioneller Neuronen und Oligodendrozyten aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gemacht. In diesem Manuskript beschreiben wir unsere optimierten Verfahren, einschließlich der Etablierung eines Kokultursystems zur Modellierung der Neuron-Oligodendrozyten-Verbindungen. Unsere illustrativen Ergebnisse deuten auf einen unerwarteten Beitrag von OPCs / Oligodendrozyten zur Amyloidose und Synapsenintegrität des Gehirns hin und unterstreichen den Nutzen dieser Methodik für die AD-Forschung. Dieser reduktionistische Ansatz ist ein mächtiges Werkzeug, um die spezifischen heterozellulären Interaktionen aus der inhärenten Komplexität im Gehirn zu sezieren. Es wird erwartet, dass die hier beschriebenen Protokolle zukünftige Studien zu oligodendroglialen Defekten in der Pathogenese der Neurodegeneration erleichtern.

Introduction

Oligodendrozyten-Linienzellen – einschließlich Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), myelinisierende Oligodendrozyten und Übergangstypen dazwischen – bilden eine Hauptgruppe menschlicher Gehirnzellen1, die aktiv an vielen kritischen Funktionen für den ordnungsgemäßen Betrieb und die Aufrechterhaltung unseres zentralen Nervensystems während der neuronalen Entwicklung und des Alterns beteiligtsind 2,3,4 . Während Oligodendrozyten dafür bekannt sind, Myelin zu produzieren, um die Übertragung neuronaler Aktivität zu erleichtern und die axonale Gesundheit in der weißen Substanz zu unterstützen, sind OPCs reichlich vorhanden (~ 5%) in der grauen Substanz, wo Myelinisierung knapp ist und aktivitätsabhängige Signalfunktionen ausführen, um das Lernverhalten und die Gedächtnisbildung zu steuern 5,6,7,8 . Wie oligodendrogliale Zellen funktionieren und dysfunktional in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit (AD) und anderer altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen ist zu wenig untersucht9. Die Unzulänglichkeiten eines geeigneten Modellsystems und Defizite im Allgemeinwissen, um einen experimentellen Weg nach vorne zu leiten, sind die Hauptgründe für diese Lücke.

Angesichts der jüngsten Durchbrüche bei der Gewinnung menschlicher Gehirnzellen aus pluripotenten Stammzellen, einschließlich embryonaler Stammzellen (ES) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS), haben sich solche zellulären Modelle in Verbindung mit modernen Gen-Editing-Tools als robuste Werkzeuge zur Handhabung des komplizierten Nexus zellulärer Interaktionen im Gehirn erwiesen und sind in der Lage, humanspezifische Krankheitsmanifestationennachzuweisen10. 11. In Anbetracht der Tatsache, dass einzelne Gehirnzelltypen angesichts der gleichen AD-fördernden Bedingungen unterschiedliche und sogar widersprüchliche Wirkungen zeigen können12,13, bietet diese Stammzellmethodik auf einzigartige Weise zelltypspezifische Informationen, die zuvor unter Verwendung etablierter In-vivo- oder In-vitro-Modelle, die nur aggregierte Messwerte aus Sammlungen von Gehirnzelltypen liefern, übersehen wurden. In den letzten zehn Jahren wurde eine große Anzahl zuverlässiger Protokolle entwickelt, um menschliche Neuronen aus Transdifferenzierung von ES/iPS-Zellen oder direkter Umwandlung aus anderen terminaldifferenzierten Zelltypen (z. B. Fibroblasten) zu erzeugen14,15. Insbesondere die Anwendung wichtiger neurogener Transkriptionsfaktoren (z.B. Neurogenin 2, Ngn2)16 auf humane pluripotente Stammzellen kann eine homogene Population gut charakterisierter neuronaler Zelltypen für Reinkulturen erzeugen, ohne dass eine Kokulturierung mit Gliazellen erforderlich ist12,17,18. Für induzierte menschliche Oligodendrozyten gibt es einige veröffentlichte Protokolle, die funktionelle Zellen erzeugen können, die ihren primären Gegenstücken sehr ähnlich sind, mit einer breiten Palette von Effizienz und Bedarf an Zeit und Ressourcen 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Bisher wurde keines dieser Protokolle angewendet, um zu untersuchen, wie oligodendrogliale Zellen auf die AD-Pathogenese reagieren und diese beeinflussen.

Hier beschreiben wir unsere verbesserten Protokolle für Einzel- und Mischkulturen von humaninduzierten Neuronen (iNs) und OPCs/Oligodendrozyten (iOPCs/iOLs). Das hier beschriebene iN-Protokoll basiert auf dem weit verbreiteten Ngn2-Ansatz16 und hat zusätzlich die Eigenschaft, gliafrei zu sein. Die resultierenden iNs sind homogen und ähneln stark den exzitatorischen Neuronen der kortikalen Schicht 2/3 mit charakteristischer pyramidaler Morphologie, Genexpressionsmuster und elektrophysiologischen Merkmalen17,18 (Abbildung 1). Um einige der grundlegenden Barrieren bei der gerichteten Differenzierung pluripotenter Stammzellen zu überwinden, haben wir eine einfache und effektive Methode der Vorbehandlung von niedrig dosiertem Dimethylsulfoxid (DMSO) entwickelt29,30 und berichteten über eine erhöhte Neigung menschlicher ES/iPS-Zellen, in iOPCs und iOLs31 zu transdifferenzieren, basierend auf einem weitgehend angepassten Protokoll von Douvaras und Fossati 32 . Wir haben das Protokoll weiter vereinfacht und eine robuste differenzierungsfördernde Verbindung, Clemastin 7,33,34, integriert, um den Prozess der oligodendroglialen Reifung zu beschleunigen. Als Ergebnis (Abbildung 2) können die iOPCs in 2 Wochen (~95% positiv für den Marker O4) und iOLs in vier Wochen (exprimierend für reife Marker MBP und PLP1) generiert werden. Interessanterweise fanden wir heraus, dass iOPCs allein eine bemerkenswerte Menge an Amyloid-β (Aβ) sezernieren, was mit den unabhängigen transkriptomischen Daten übereinstimmt, die die reichliche Expression des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) und der Verarbeitungsprotease β-Sekretase (BACE1) in Oligodendrozyten-Linienzellen35,36 zeigen. Darüber hinaus fördert unser iN-iOPC-Kokultursystem die Umhüllung von Axonen durch MBP-positive iOL-Prozesse und bietet eine signifikante Unterstützung für die Synapsenbildung (Abbildung 3). Daher haben die Protokolle, die wir unten beschrieben haben, technische und biologische Vorteile gegenüber zuvor katalogisierten Neuron-Oligodendroglia-Co-Kultivierungsmethoden und versprechen eine bessere Modellierung der Neurodegeneration bei AD.

Protocol

1. Induktion menschlicher Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen Lentivirus-Vorbereitung (~5 Tage, detailliertes Protokoll wie zuvor beschrieben16)Platte ~ 1 Million HEK293T-Zellen jeder T75-Kolben, um sie ~ 40% konfluent zu haben, wenn Transfektion durchgeführt wird. Transfizieren Sie sie mit Plasmiden, die Tetracyclin-induzierbares Ngn2 und puromycin-resistentes Gen (PuroR; unter derselben TetO-Promotorkontrolle), rtTA und die drei Helferplasmide pRSV-REV, pMDLg/pRRE u…

Representative Results

Direkte Erzeugung von humaninduzierten Neuronen aus humanen pluripotenten StammzellenEs ist sehr wichtig, dass die startenden humanen pluripotenten Stammzellen einen hohen Grad an Pluripotenz für die erfolgreiche Erzeugung von iNs oder iOPCs/iOLs aufweisen. Daher sollten Zellen auf bestimmte Marker wie Oct4 und SOX2 gefärbt werden, bevor eines der im vorliegenden Manuskript beschriebenen Induktionsprotokolle gestartet wird (Abbildung 1A). Menschliche H1-Zellen wurden v…

Discussion

Neben der physikalischen und metabolischen Unterstützung zur Stabilisierung der Synapsenstrukturen und zur Erleichterung der salzatorischen Signalleitung durch Myelinisierung können Oligodendrozyten-Linienzellen neuronale Aktivitätsmuster durch schnelle und dynamische Cross-Talks mit Neuronen 5,6,7 formen. Während in der AD-Pathologie die oligodendroglialen Reaktionen zunächst lediglich als sekundär zu Entzündungen und ox…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health (R00 AG054616 an Y.A.H. und T32 GM136566 an K.C.), der Stanford University School of Medicine und eines Siebel Fellowship (vergeben an S.C.) unterstützt. Y.A.H. ist DaF Translational Professor am Center for Translational Neuroscience am Brown Institute for Translational Sciences.

Materials

Accutase STEMCELL Technologies 7920
B27 supplement ThermoFisher 17504044
bFGF ThermoFisher PHG 0266
cAMP MilliporeSigma A9501
Clemastine MilliporeSigma SML0445
DMEM/F12 medium STEMCELL Technologies 36254
DMSO ThermoFisher D12345
Doxycycline MilliporeSigma D3072
Fetal Bovine Serum ScienCell 10
H1 human ES cells WiCell WA01
Matrigel Corning 354234
mTeSR plus STEMCELL Technologies 5825
N2 supplement ThermoFisher 17502001
Neurobasal A medium ThermoFisher 10888-022
Non Essential Amino Acids ThermoFisher 11140-050
PDGF-AA R&D Systems 221-AA-010
PEI VWR 71002-812
pMDLg/pRRE Addgene 12251
Polybrene MilliporeSigma TR-1003-G
pRSV-REV Addgene 12253
Puromycin ThermoFisher A1113803
ROCK Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72302
SAG Tocris 4366
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media STEMCELL Technologies 5838
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit STEMCELL Technologies 8581
T3 triiodothyronine MilliporeSigma T6397
Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs Tempo BioScience SKU102
TetO-Ng2-Puro Addgene 52047
VSV-G Addgene 12259
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References

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Assetta, B., Tang, C., Bian, J., O’Rourke, R., Connolly, K., Brickler, T., Chetty, S., Huang, Y. A. Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. J. Vis. Exp. (165), e61778, doi:10.3791/61778 (2020).
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