多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化
Summary
神経変性におけるニューロンとグリアの相互作用は、ツールや方法が不十分なため、よく理解されていません。ここでは、ヒト多能性幹細胞から誘導されたニューロン、希突起膠細胞前駆細胞、および希突起膠細胞を取得するための最適化されたプロトコルについて説明し、アルツハイマー病における細胞種特異的な寄与を理解する上でのこれらの方法の価値の例を提供します。
Abstract
アルツハイマー病(AD)やその他の神経変性疾患では、希突起膠障害は一般的な初期の病理学的特徴ですが、特に脳の灰白質において、それが疾患の発症と進行にどのように寄与するかはほとんど不明のままです。希突起膠細胞系譜細胞の機能不全は、髄鞘形成の欠損および希突起膠細胞前駆細胞(OPC)の自己複製障害によって特徴付けられる。これらの2つの欠陥は、病理学の蓄積に沿ったニューロンと希突起膠細胞の間の相互作用の混乱によって少なくとも部分的に引き起こされます。OPCは、CNSの発生中に有髄性希突起膠細胞を生じさせる。成熟した脳皮質では、OPCは主要な増殖細胞(全脳細胞の~5%を占める)であり、神経活動依存的に新しいミエリン形成を制御します。このようなニューロンから希突起膠細胞へのコミュニケーションは、適切なツールがないため、特にADなどの神経変性状態の状況では、かなり研究されていません。近年、私たちのグループなどは、ヒト多能性幹細胞から機能的なニューロンと希突起膠細胞を個別に生成するために、現在利用可能なプロトコルを改善するための大きな進歩を遂げました。本稿では、ニューロン-希突起膠細胞結合をモデル化するための共培養システムの確立など、最適化された手順について説明します。私たちの実例となる結果は、OPC /希突起膠細胞が脳アミロイドーシスとシナプスの完全性に予想外の寄与をしていることを示唆しており、AD研究におけるこの方法論の有用性を強調しています。この還元主義的アプローチは、脳内の固有の複雑さから特定のヘテロ細胞相互作用を分析するための強力なツールです。ここで説明するプロトコルは、神経変性の病因における希突起膠原欠陥に関する将来の研究を促進することが期待されます。
Introduction
希突起膠細胞前駆細胞(OPC)、有髄性希突起膠細胞、およびその間の移行型を含む希突起膠細胞系譜細胞は、ヒト脳細胞の主要なグループを構成しています1神経発達と老化を通して中枢神経系の適切な操作と維持のための多くの重要な機能に積極的に関与しています2,3,4.希突起膠細胞は、白質のニューロン活動伝達を促進し、軸索の健康をサポートするミエリンを産生することでよく知られていますが、OPCは髄鞘形成がほとんどない灰白質に豊富(~5%)存在し、学習行動と記憶形成を制御する活動依存性シグナル伝達機能を実行します5,6,7,8 .アルツハイマー病(AD)やその他の加齢に伴う神経変性状態の病因における希突起膠細胞がどのように機能し、機能不全になるかは十分に研究されていません9。適切なモデルシステムの不十分さと、実験の道を前進させるための一般的な知識の不足が、このギャップの主な理由です。
胚性幹(ES)および人工多能性幹(iPS)細胞を含む多能性幹細胞からヒト脳細胞を誘導する最新のブレークスルーに照らして、そのような細胞モデルは、最新の遺伝子編集ツールと組み合わせて、脳内の細胞相互作用の複雑なネクサスを処理するための堅牢なツールとして浮上しており、ヒト特異的な疾患症状を実証することができます10。11.個々の脳細胞タイプは、同じAD促進条件に直面しても明確で相反する効果を示す可能性があることを考慮すると12,13、この幹細胞方法論は、脳細胞タイプのコレクションからの集計読み取りのみを提供する確立されたin vivoまたはin vitroモデルを使用して以前に見逃されていた細胞タイプ固有の情報を独自に提供します。過去10年間で、ES/iPS細胞の分化形質転換または他の最終分化細胞タイプ(線維芽細胞など)からの直接変換からヒトニューロンを生成するために、多くの信頼性の高いプロトコルが開発されてきました14,15。特に、重要な神経原性転写因子(例えば、ニューロゲニン2、Ngn2)16をヒト多能性幹細胞に適用することで、グリア細胞との共培養を必要とせずに、純粋培養用の十分に特徴付けられた神経細胞タイプの均質な集団を生成することができます12、17、18。誘導されたヒト希突起膠細胞については、主要な対応物に非常に類似した機能細胞を生成できるいくつかの公開されたプロトコルがあり、時間とリソースにおいて幅広い効率と需要があります19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 .今日まで、これらのプロトコルのいずれも、希突起膠細胞がどのように応答し、AD病因に影響を与えるかを調査するために適用されていません。
ここでは、ヒト誘導ニューロン(iN)およびOPC/希突起膠細胞(iOPC / iOL)の単一および混合培養のための改善されたプロトコルについて説明します。ここで説明するiNプロトコルは、広く使用されているNgn2アプローチ16に基づいており、グリアフリーであるという追加的な特徴を有する。得られたiNは均質で、皮質層の2/3興奮性ニューロンに非常に似ており、特徴的な錐体形態、遺伝子発現パターン、および電気生理学的特徴を備えています17,18(図1)。多能性幹細胞の指向性分化における基本的な障壁のいくつかを克服するために、我々は、低用量ジメチルスルホキシド(DMSO)前処理の簡単で効果的な方法を開発し29,30、そしてDouvarasとFossati 32によって広く適応されたプロトコルに基づいて、ヒトES/iPS細胞がiOPCとiOLに分化形質転換する傾向が高まったことを報告しました31。.プロトコルをさらに簡素化し、強力な分化促進化合物であるクレマスチン7,33,34を組み込んで、希突起膠の成熟プロセスを加速しました。その結果(図2)、iOPCは2週間で生成され(マーカーO4に対して~95%陽性)、iOLは4週間で生成されます(成熟マーカーMBPおよびPLP1を発現)。興味深いことに、iOPC単独では顕著な量のアミロイドβ(Aβ)を分泌し、希突起膠細胞系統細胞におけるアミロイド前駆体タンパク質(APP)およびプロセシングプロテアーゼβセクレターゼ(BACE1)の豊富な発現を示す独立したトランスクリプトームデータと一致しています35,36。さらに、当社のiN-iOPC共培養システムは、MBP陽性iOLプロセスによる軸索の被覆を促進し、シナプス形成を大いにサポートします(図3)。したがって、以下に詳述するプロトコルは、以前にカタログ化されたニューロン-オリゴデンドログリア共培養法に比べて技術的および生物学的利点があり、ADにおける神経変性をより適切にモデル化する上で有望です。
Protocol
Representative Results
Discussion
希突起膠細胞系譜細胞は、シナプス構造を安定化させ、髄鞘形成による塩状シグナル伝導を促進するための物理的および代謝的サポートに加えて、ニューロンとの迅速かつ動的なクロストークを介してニューロン活動パターンを形成することができます5,6,7。AD病理学では、オリゴデンドログリア応答は当初、炎症と酸化?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(R00 AG054616からYAHおよびT32 GM136566からK.C.)、スタンフォード大学医学部、およびシーベルフェローシップ(SCに授与)からの助成金によってサポートされました。Y.A.H.は、ブラウントランスレーショナルサイエンス研究所のトランスレーショナルニューロサイエンスセンターのGFLトランスレーショナル教授です。
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
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