Generering av humane nevroner og oligodendrocytter fra pluripotente stamceller for modellering av neuron-oligodendrococyttinteraksjoner
Summary
Neuron-glial-interaksjonene i nevrodegenerasjon er ikke godt forstått på grunn av utilstrekkelige verktøy og metoder. Her beskriver vi optimaliserte protokoller for å oppnå induserte nevroner, oligodendrocytter forløperceller og oligodendrocytter fra humane pluripotente stamceller og gir eksempler på verdiene av disse metodene for å forstå celletypespesifikke bidrag i Alzheimers sykdom.
Abstract
Ved Alzheimers sykdom (AD) og andre nevrodegenerative lidelser er oligodendroglial svikt et vanlig tidlig patologisk trekk, men hvordan det bidrar til sykdomsutvikling og progresjon, spesielt i hjernens grå substans, forblir stort sett ukjent. Dysfunksjonen av oligodendrocytter er preget av mangler i myelinisering og nedsatt selvfornyelse av oligodendrocytter forløperceller (OPC). Disse to feilene skyldes i det minste delvis forstyrrelsen av interaksjoner mellom nevron og oligodendrocytter langs oppbyggingen av patologi. OPC gir myeliniserende oligodendrocytter under CNS-utvikling. I den modne hjernebarken er OPCs de viktigste proliferative cellene (som består av ~ 5% av totale hjerneceller) og kontrollerer ny myelindannelse på en nevral aktivitetsavhengig måte. Slike neuron-til-oligodendrococyte-kommunikasjoner er betydelig understudert, spesielt i sammenheng med neurodegenerative tilstander som AD, på grunn av mangel på passende verktøy. I de senere år har vår gruppe og andre gjort betydelige fremskritt for å forbedre tilgjengelige protokoller for å generere funksjonelle nevroner og oligodendrocytter individuelt fra humane pluripotente stamceller. I dette manuskriptet beskriver vi våre optimaliserte prosedyrer, inkludert etablering av et samkultursystem for å modellere nevron-oligodendrocytterforbindelsene. Våre illustrerende resultater tyder på et uventet bidrag fra OPC / oligodendrocytter til hjerneamyloidose og synapseintegritet og fremhever nytten av denne metoden for AD-forskning. Denne reduksjonistiske tilnærmingen er et kraftig verktøy for å dissekere de spesifikke heterocellulære interaksjonene ut av den iboende kompleksiteten i hjernen. Protokollene vi beskriver her forventes å lette fremtidige studier på oligodendrogliale defekter i patogenesen av nevrodegenerasjon.
Introduction
Oligodendrocytter avstamningsceller – inkludert oligodendrocytter forløperceller (OPC), myeliniserende oligodendrocytter og overgangstyper i mellom – utgjør en stor gruppe humane hjerneceller1 som aktivt deltar i mange kritiske funksjoner for riktig drift og vedlikehold av sentralnervesystemet gjennom nevral utvikling og aldring 2,3,4 . Mens oligodendrocytter er kjent for å produsere myelin for å lette nevronaktivitetsoverføring og støtte aksonal helse i hvit substans, er OPCs rikelig (~ 5%) i grå substans hvor myelinisering er knapp og utfører aktivitetsavhengige signalfunksjoner for å styre læringsadferd og minnedannelse 5,6,7,8 . Hvordan oligodendrogliale celler fungerer og dysfunksjon i patogenesen av Alzheimers sykdom (AD) og andre aldersassosierte nevrodegenerative tilstander har blitt studert9. Utilstrekkeligheten til et passende modellsystem og mangler i generell kunnskap for å lede en eksperimentell vei fremover er de viktigste årsakene til dette gapet.
I lys av de siste gjennombruddene i å utlede menneskelige hjerneceller fra pluripotente stamceller, inkludert embryonale stamceller (ES) og induserte pluripotente stamceller (iPS), har slike cellulære modeller i forbindelse med moderne genredigeringsverktøy dukket opp som robuste verktøy for å håndtere den intrikate sammenhengen mellom cellulære interaksjoner i hjernen, og er i stand til å demonstrere menneskespesifikke sykdomsmanifestasjoner10, 11. Med tanke på at individuelle hjernecelletyper kan utvise forskjellige og til og med motstridende effekter i møte med de samme AD-fremmende forholdene12,13, tilbyr denne stamcellemetodikken unikt celletypespesifikk informasjon som tidligere har blitt savnet ved hjelp av etablerte in vivo- eller in vitro-modeller som bare gir samlede avlesninger fra samlinger av hjernecelletyper. I løpet av det siste tiåret har et stort antall pålitelige protokoller blitt utviklet for å generere humane nevroner fra transdifferensiering av ES / iPS-celler eller direkte konvertering fra andre terminalt differensierte celletyper (f.eks. fibroblaster) 14,15. Spesielt kan anvendelsen av viktige nevrogene transkripsjonsfaktorer (f.eks. Neurogenin 2, Ngn2)16 til humane pluripotente stamceller generere en homogen populasjon av godt karakteriserte nevroncelletyper for rene kulturer uten behov for kokulturering med gliaceller12,17,18. For induserte humane oligodendrocytter er det noen få publiserte protokoller som kan generere funksjonelle celler som ligner deres primære kolleger, med et bredt spekter av effektivitet og etterspørsel i tid og ressurser 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Til dags dato har ingen av disse protokollene blitt brukt til å undersøke hvordan oligodendrogliale celler reagerer på og påvirker AD-patogenesen.
Her beskriver vi våre forbedrede protokoller for enkle og blandede kulturer av humaninduserte nevroner (iNs) og OPC / oligodendrocytter (iOPCs / iOLs). iN-protokollen beskrevet her er basert på den mye brukte Ngn2-tilnærmingen16, og har den ekstra funksjonen å være gliafri. De resulterende iN-ene er homogene og ligner sterkt på de kortikale lag 2/3 eksitatoriske nevronene, med karakteristisk pyramidemorfologi, genuttrykksmønster og elektrofysiologiske trekk17,18 (figur 1). For å overvinne noen av de grunnleggende barrierene i rettet differensiering av pluripotente stamceller, har vi utviklet en enkel og effektiv metode for lavdose dimetylsulfoksid (DMSO) forbehandling29,30, og rapportert en forbedret tilbøyelighet til humane ES / iPS-celler til å transdifferensiere til iOPCs og iOLs31, basert på en bredt tilpasset protokoll av Douvaras og Fossati 32 . Vi har ytterligere forenklet protokollen og innlemmet en robust differensieringsfremmende forbindelse, clemastine 7,33,34, for å akselerere prosessen med oligodendroglial modning. Som et resultat (figur 2) kan iOPCs genereres på 2 uker (~ 95% positive for markøren O4) og iOLs om fire uker (uttrykker modne markører MBP og PLP1). Interessant nok fant vi at iOPCs alene utskiller en bemerkelsesverdig mengde amyloid-β (Aβ), i samsvar med de uavhengige transkriptomiske dataene som viser rikelig ekspresjon av amyloidforløperproteinet (APP) og behandlingsproteasen β-sekretase (BACE1) i oligodendrococyttlinjeceller35,36. Videre fremmer vårt iN-iOPC-kokultursystem ensheathing av aksoner ved MBP-positive iOL-prosesser og gir betydelig støtte til synapsedannelse (figur 3). Dermed har protokollene vi har beskrevet nedenfor tekniske og biologiske fordeler i forhold til tidligere katalogiserte neuron-oligodendroglia co-culturing metoder, og holder et løfte om bedre modellering av nevrodegenerasjonen i AD.
Protocol
Representative Results
Discussion
I tillegg til den fysiske og metabolske støtten for å stabilisere synapsestrukturene og for å lette den saltatoriske signalledningen ved myelinisering, kan oligodendrocytterlinjeceller forme nevronaktivitetsmønster via raske og dynamiske krysssamtaler med nevroner 5,6,7. Mens oligodendroglialresponsene i AD-patologi i utgangspunktet ble ansett som bare sekundære til betennelse og oksidativt stress, er det nå lovende bevis …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R00 AG054616 til Y.A.H. og T32 GM136566 til K.C.), Stanford University School of Medicine og et Siebel Fellowship (tildelt SC). Y.A.H. er en GFL Translational Professor fra Center for Translational Neuroscience i Brown Institute for Translational Sciences.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
References
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
- Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
- Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer’s disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
- Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
- TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
- Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
- Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer’s Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
- Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
- Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
- Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
- Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
- Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
- Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
- Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
- Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
- Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
- Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
- Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
- Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
- Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
- Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).
