Generering av humana neuroner och oligodendrocyter från pluripotenta stamceller för modellering av neuron-oligodendrocytinteraktioner
Summary
Neuron-glial interaktioner i neurodegeneration är inte väl förstådda på grund av otillräckliga verktyg och metoder. Här beskriver vi optimerade protokoll för att erhålla inducerade neuroner, oligodendrocytprekursorceller och oligodendrocyter från humana pluripotenta stamceller och ger exempel på värdena för dessa metoder för att förstå celltypspecifika bidrag vid Alzheimers sjukdom.
Abstract
Vid Alzheimers sjukdom (AD) och andra neurodegenerativa sjukdomar är oligodendroglial misslyckande ett vanligt tidigt patologiskt drag, men hur det bidrar till sjukdomsutveckling och progression, särskilt i hjärnans grå substans, är fortfarande i stort sett okänt. Dysfunktionen hos oligodendrocytceller kännetecknas av brister i myelinering och nedsatt självförnyelse av oligodendrocytprekursorceller (OPC). Dessa två defekter orsakas åtminstone delvis av störningen av interaktioner mellan neuron och oligodendrocyter längs uppbyggnaden av patologi. OPC ger upphov till myeliniserande oligodendrocyter under CNS-utveckling. I den mogna hjärnbarken är OPC de viktigaste proliferativa cellerna (som omfattar ~ 5% av de totala hjärncellerna) och kontrollerar ny myelinbildning på ett neuralt aktivitetsberoende sätt. Sådan neuron-till-oligodendrocytkommunikation är signifikant understuderad, särskilt i samband med neurodegenerativa tillstånd såsom AD, på grund av bristen på lämpliga verktyg. Under de senaste åren har vår grupp och andra gjort betydande framsteg för att förbättra för närvarande tillgängliga protokoll för att generera funktionella neuroner och oligodendrocyter individuellt från humana pluripotenta stamceller. I detta manuskript beskriver vi våra optimerade procedurer, inklusive upprättandet av ett samodlingssystem för att modellera neuron-oligodendrocytanslutningarna. Våra illustrativa resultat tyder på ett oväntat bidrag från OPCs / oligodendrocyter till hjärnans amyloidos och synapsintegritet och belyser nyttan av denna metod för AD-forskning. Detta reduktionistiska tillvägagångssätt är ett kraftfullt verktyg för att dissekera de specifika heterocellulära interaktionerna ur den inneboende komplexiteten i hjärnan. De protokoll vi beskriver här förväntas underlätta framtida studier av oligodendrogliala defekter i patogenesen av neurodegeneration.
Introduction
Oligodendrocythärstamningsceller – inklusive oligodendrocytprekursorceller (OPC), myeliniserande oligodendrocyter och övergångstyper däremellan – utgör en stor grupp mänskliga hjärnceller1 som aktivt deltar i många kritiska funktioner för korrekt drift och underhåll av vårt centrala nervsystem under hela neural utveckling och åldrande 2,3,4 . Medan oligodendrocyter är välkända för att producera myelin för att underlätta neuronal aktivitetsöverföring och stödja axonal hälsa i vit substans, är OPC rikliga (~ 5%) i grå substans där myelinering är knapp och utför aktivitetsberoende signalfunktioner för att styra inlärningsbeteende och minnesbildning 5,6,7,8 . Hur oligodendrogliala celler fungerar och dysfunktion i patogenesen av Alzheimers sjukdom (AD) och andra åldersassocierade neurodegenerativa tillstånd har understuderats9. Bristerna i ett lämpligt modellsystem och brister i den allmänna kunskapen för att vägleda en experimentell väg framåt är de främsta orsakerna till denna klyfta.
Mot bakgrund av de senaste genombrotten när det gäller att härleda mänskliga hjärnceller från pluripotenta stamceller, inklusive embryonala stamceller (ES) och inducerade pluripotenta stamceller (iPS), har sådana cellulära modeller i kombination med moderna genredigeringsverktyg framträtt som robusta verktyg för att hantera den invecklade kopplingen mellan cellulära interaktioner i hjärnan och kan visa människospecifika sjukdomsmanifestationer10, 11. Med tanke på att enskilda hjärncellstyper kan uppvisa distinkta och till och med motstridiga effekter inför samma AD-främjande förhållanden12,13, erbjuder denna stamcellsmetodik unikt celltypspecifik information som tidigare har missats med hjälp av etablerade in vivo- eller in vitro-modeller som endast ger aggregerade avläsningar från samlingar av hjärncellstyper. Under det senaste decenniet har ett stort antal tillförlitliga protokoll utvecklats för att generera mänskliga neuroner från transdifferentiering av ES / iPS-celler eller direkt omvandling från andra terminalt differentierade celltyper (t.ex. fibroblaster)14,15. I synnerhet kan tillämpningen av viktiga neurogena transkriptionsfaktorer (t.ex. neurogenin 2, Ngn2)16 på humana pluripotenta stamceller generera en homogen population av väl karakteriserade neuronala celltyper för rena kulturer utan behov av coculturing med gliaceller12,17,18. För inducerade humana oligodendrocyter finns det några publicerade protokoll som kan generera funktionella celler som mycket liknar deras primära motsvarigheter, med ett brett spektrum av effektivitet och efterfrågan i tid och resurser 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Hittills har inget av dessa protokoll tillämpats för att undersöka hur oligodendrogliala celler svarar på och påverkar AD-patogenes.
Här beskriver vi våra förbättrade protokoll för enstaka och blandade kulturer av humaninducerade neuroner (iNs) och OPCs/oligodendrocyter (iOPCs/iOLs). iN-protokollet som beskrivs här är baserat på den allmänt använda Ngn2-metoden16 och har den ytterligare funktionen att vara gliafri. De resulterande iN är homogena och liknar starkt de kortikala skiktet 2/3 excitatoriska neuroner, med karakteristisk pyramidal morfologi, genuttrycksmönster och elektrofysiologiska egenskaper17,18 (Figur 1). För att övervinna några av de grundläggande hindren för riktad differentiering av pluripotenta stamceller har vi utvecklat en enkel och effektiv metod för lågdos dimetylsulfoxid (DMSO) förbehandling29,30 och rapporterat en ökad benägenhet hos humana ES / iPS-celler att transdifferentiera till iOPCs och iOLs31, baserat på ett allmänt anpassat protokoll av Douvaras och Fossati 32 . Vi har ytterligare förenklat protokollet och införlivat en robust differentieringsfrämjande förening, clemastine 7,33,34, för att påskynda processen för oligodendroglial mognad. Som ett resultat (figur 2) kan iOPC: erna genereras på 2 veckor (~ 95% positiva för markören O4) och iOL på fyra veckor (uttrycker mogna markörer MBP och PLP1). Intressant nog fann vi att iOPCs ensamma utsöndrar en anmärkningsvärd mängd amyloid-β (Aβ), i överensstämmelse med de oberoende transkriptomiska data som visar det rikliga uttrycket av amyloidprekursorproteinet (APP) och bearbetningsproteas β-sekretas (BACE1) i oligodendrocythärstamningsceller35,36. Dessutom främjar vårt iN-iOPC-samodlingssystem inneslutningen av axoner genom MBP-positiva iOL-processer och ger betydande stöd för synapsbildning (figur 3). Således har de protokoll som vi har beskrivit nedan tekniska och biologiska fördelar jämfört med tidigare katalogiserade neuron-oligodendroglia co-culturing-metoder och har ett löfte om bättre modellering av neurodegenerationen i AD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förutom det fysiska och metaboliska stödet för att stabilisera synapsstrukturerna och för att underlätta den saltatoriska signalledningen genom myelinering, kan oligodendrocytceller forma neuronalt aktivitetsmönster via snabba och dynamiska korssamtal med neuroner 5,6,7. Medan oligodendrogliala svar i AD-patologi ursprungligen betraktades som endast sekundära till inflammation och oxidativa påfrestningar, finns det nu lo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (R00 AG054616 till Y.A.H. och T32 GM136566 till K.C.), Stanford University School of Medicine och ett Siebel Fellowship (tilldelas SC). Y.A.H. är en GFL Translational Professor från Center for Translational Neuroscience vid Brown Institute for Translational Sciences.
Materials
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxycycline | MilliporeSigma | D3072 | |
| Fetal Bovine Serum | ScienCell | 10 | |
| H1 human ES cells | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| N2 supplement | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Non Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media | STEMCELL Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | STEMCELL Technologies | 8581 | |
| T3 triiodothyronine | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
References
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer’s disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
- Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
- Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
- Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
- Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer’s disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
- Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
- TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
- Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
- Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer’s disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer’s Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
- Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
- Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
- Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
- Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
- Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
- Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
- Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
- Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
- Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
- Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
- Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
- Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
- Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
- Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
- Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
- Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).
