Rimozione e sostituzione di ligandi endogeni da proteine e allergeni legati ai lipidi
Summary
Questo protocollo descrive la rimozione dei lipidi endogeni dagli allergeni e la loro sostituzione con ligandi specificati dall’utente attraverso HPLC in fase inversa accoppiato con ricottura termica. 31 di cui: La commissione per la P-NMR e dicroismo circolare consentono la rapida conferma della rimozione/caricamento del ligando e il recupero della struttura allergenica nativa.
Abstract
Molti allergeni principali si legano a molecole idrofobiche lipidiche, tra cui Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 e Fel d 1. Questi ligandi sono fortemente mantenuti e hanno il potenziale per influenzare il processo di sensibilizzazione stimolando direttamente il sistema immunitario o alterando le proprietà biofisiche della proteina allergenica. Al fine di controllare queste variabili, sono necessarie tecniche per la rimozione dei ligandi legati endogenamente e, se necessario, la sostituzione con lipidi di composizione nota. L’allergene scarafaggio Bla g 1 racchiude una grande cavità idrofobica che lega una miscela eterogenea di lipidi endogeni quando purificata con tecniche tradizionali. Qui descriviamo un metodo attraverso il quale questi lipidi vengono rimossi utilizzando HPLC in fase inversa seguito da ricottura termica per produrre Bla g 1 nella sua forma Apo o ricaricati con una miscela definita dall’utente di acidi grassi o carichi fosfolipidici. L’accoppiamento di questo protocollo con saggi biochimici rivela che i carichi di acidi grassi alterano significativamente la termostabilità e la resistenza proteolitica di Bla g 1, con implicazioni a valle per il tasso di generazione di epitopi delle cellule T e allergenicità. Questi risultati evidenziano l’importanza dei protocolli di rimozione/ricarica lipidica come quello descritto nel presente documento quando si studiano gli allergeni provenienti sia da fonti ricombinanti che naturali. Il protocollo è generalizzabile ad altre famiglie di allergeni tra cui lipocaline (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) e Uteroglobina (Fel d 1), fornendo un prezioso strumento per studiare il ruolo dei lipidi nella risposta allergica.
Introduction
Un’indagine del database degli allergeni rivela che gli allergeni si trovano solo nel 2% di tutte le famiglie proteiche conosciute, suggerendo che le proprietà funzionali e biofisiche comuni contribuiscono all’allergenicità1. Di queste proprietà, la capacità di legare carichi lipidici sembra essere fortemente sovrarappresentate tra gli allergeni, suggerendo che questi carichi possono influenzare il processo di sensibilizzazione1. In effetti, è stato dimostrato che l’allergene della noce del Brasile Ber e 1 richiede la co-somministrazione con il suo lipide endogeno per realizzare il suo pieno potenzialesensibilizzante 2. Questi lipidi potrebbero potenzialmente stimolare il sistema immunitariodirettamentecome illustrato dagli allergeni degli acari Der p 2 e Der p 7, entrambi condividono una forte omologia strutturale con proteine leganti LPS 3,4,5. Sulla base di questa osservazione è stato proposto che Derp 2 e Der p 7 potessero legare lipidi batterici e stimolare direttamente il sistema immunitario ospite attraverso la segnalazione mediata da TLR4, facilitando il processo di sensibilizzazione5,6. È anche possibile che i lipidi legati endogenamente possano alterare le proprietà biofisiche delle stesse proteine allergeniche. Ad esempio, la capacità di Sin a 2 (senape) e Ara h 1 (arachidi) di interagire con vescicole fosfolipidiche ha aumentato significativamente la loro resistenza alla degradazione gastrica ed endosomica7, mentre il legante al principale allergene di polline di betulla Bet v 1 ha alterato sia il tasso di lavorazione endosomica che la diversità dei peptidirisultanti 8. Ciò è particolarmente rilevante per l’allergenicità data la correlazione osservata tra stabilità, generazione di epitopi delle cellule T e allergenicità per proteine come Bet v 1 e Bla g 1; quest’ultimo sarà oggetto di questo lavoro9,10.
Bla g 1 rappresenta il membro prototipo della famiglia proteica dell’insetto Major Allergen (MA) e possiede una struttura unica composta da 12 alfa eliche anfipatiche che racchiudono una cavità idrofobica anormalmentegrande 9,11. La struttura cristallina a raggi X disponibile di Bla g 1 mostra la densità degli elettroni all’interno di questa cavità coerente con i ligandi fosfolipidici o acidi grassi legati; una congettura confermata da 31P-NMR e spettrometria di massa. Questi carichi erano di natura eterogenea e la loro composizione dipendeva fortemente dalla fonte allergenica, con diversi profili lipidici osservati per il ricombinante Bla g 1 espresso in E. coli e P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificato dalla sua fonte naturale di allergeni (frass di scarafaggio) conteneva prevalentemente acidi grassi all’interno del suo sito di legame, con una miscela di palmitato, oleato e stearato identificati come suoi ligandi “naturali”9,11. La capacità di Bla g 1 di trattenere lipidi e acidi grassi a seguito di molteplici fasi di purificazione ostacola gli sforzi per studiare la proteina in isolamento. Al contrario, è stato suggerito che i ligandi naturali palmitati, stearati e oleati di Bla g 1 (d’ora in poi denominati nMix) svolgano un ruolo chiave sia nella sua allergenicità che nella funzione biologica nativa9. Tuttavia, questi ligandi non sono presenti nel Bla g 1 ottenuto da fonti ricombinanti, rendendo difficile valutare questa ipotesi. Problemi simili sono stati osservati per altri allergeni leganti lipidici come Bet v 112,13. Per facilitare lo studio sistematico delle interazioni lipidico-allergene abbiamo sviluppato un protocollo attraverso il quale gli allergeni possono essere quantitativamente spogliati dei loro lipidi legati endogenamente e ricostituiti in forma Apo o caricati con ligandi specifici.
Gli allergeni sono più comunemente purificati dalle loro fonti naturali o ricombinanti usando cromatografia di affinità e/o cromatografia ad esclusione di dimensioni. Qui, introduciamo un ulteriore passaggio di purificazione sotto forma di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) impiegando una colonna C18 in fase inversa da cui l’allergene viene eluito in un solvente organico simile ai protocolli sviluppati per le proteine leganti gli acidigrassi 14. La proteina risultante viene quindi sottoposta a una fase di ricottura termica in assenza o presenza di acidi grassi e/o fosfolipidi. Oltre a recuperare la piega nativa Bla g 1, le temperature elevate aumentano la solubilità e l’accessibilità dei carichi lipidici, producendo Bla g 1 in forma di Apo o caricati uniformemente con il ligando idrofobico desiderato. 31 di cui: La commissione per la Gli spettri P-NMR di Bla g 1 purificati in questo modo hanno confermato la completa rimozione dei ligandi legati endogenamente e la sostituzione uniforme con i composti desiderati, mentre il dicroismo circolare ha confermato il successo del recupero della piega Bla g 1. L’utilità di questo metodo è evidenziata in un recente lavoro in cui è stato trovato il legame del carico per migliorare la termostabilità e la resistenza proteolitica bla g 1, alterando la cinetica della generazione di epitopi delle cellule T con potenziali implicazioni per la sensibilizzazione e l’allergenicità9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto in questo lavoro è stato applicato con successo per studiare sistematicamente le proprietà di legame lipidico di Bla g 1. Ciò ha rivelato una correlazione tra legame del carico, termostabilità e lavorazione endosomica, quest’ultima correlata alla diminuzione della generazione di un epitopo noto delle cellule T con potenziali implicazioni per l’immunogenicità9,18. Oltre a Bla g 1, altri allergeni come Pru p 3 e Bet v 1 hanno dimostrato…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Tom Kirby, Scott Gabel e il Dr. Robert London per il loro aiuto e assistenza durante tutto questo lavoro, insieme al Dr. Bob Petrovich e Lori Edwards per l’uso della loro strumentazione e la loro assistenza nella generazione dei costrutti Bla g 1 impiegati in questo studio. Ringraziamo Andrea Adams per l’assistenza con la spettrometria di massa e il Dott. Eugene DeRose per l’assistenza con la strumentazione NMR. Questa ricerca è stata supportata dal Programma di ricerca intramurale del NIH, Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale, Z01-ES102906 (GAM). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell’Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
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