نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون
Summary
يقدم هذا البروتوكول نظاما جديدا وقويا وقابلا للاستنساخ لتوليد وزراعة كرويات ثلاثية الأبعاد من خلايا الورم الغدي القولون Caco2. تقدم النتائج أول دليل على المفهوم لعدم ملاءمة هذا النهج لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية السرطانية ، بما في ذلك الاستجابة للعلاج الكيميائي.
Abstract
تتميز سرطانات القولون والمستقيم بعدم التجانس ومنظمة هرمية تضم مجموعة من الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) المسؤولة عن تطور الورم وصيانته ومقاومته للأدوية. وبالتالي، فإن الفهم الأفضل لخصائص CSC لاستهدافها المحدد هو شرط مسبق للعلاج الفعال. ومع ذلك، هناك ندرة في النماذج السابقة السريرية المناسبة لإجراء تحقيقات متعمقة. على الرغم من أن خطوط الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد (2D) في المختبر توفر رؤى قيمة في بيولوجيا الورم ، إلا أنها لا تكرر عدم تجانس الورم الظاهري والوراثي. في المقابل، تعالج النماذج ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وتتكاثر تعقيد السرطان شبه الفسيولوجي وتغايرية الخلايا. وكان الهدف من هذا العمل تصميم نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قوي وقابل للاستنساخ لدراسة بيولوجيا CSC. تصف المنهجية الحالية تطوير وتحسين الظروف لتوليد كرويدات ثلاثية الأبعاد ، وهي متجانسة في الحجم ، من خلايا الكاكو2 الغدية القولونية ، وهو نموذج يمكن استخدامه للثقافة على المدى الطويل. والأهم من ذلك، داخل كرويدات، الخلايا التي نظمت حول هياكل تشبه التجويف، وتتميز أنماط انتشار الخلايا التفاضلية ووجود CSCs التعبير عن لوحة من علامات. توفر هذه النتائج أول دليل على المفهوم لعدم ملاءمة هذا النهج ثلاثي الأبعاد لدراسة تغايرية الخلايا وبيولوجيا CSC ، بما في ذلك الاستجابة للعلاج الكيميائي.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) لا يزال السبب الرئيسي الثاني للوفيات المرتبطة بالسرطان في العالم1. تطوير لجنة حقوق الطفل هو نتيجة لاكتساب تدريجي وتراكم الطفرات الوراثية و / أو التعديلات اللاجينية2،3، بما في ذلك تفعيل الأورام وتثبيط الجينات المثبطة للورم3،4. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسهم العوامل غير الوراثية (مثل البيئة الدقيقة) في التحول الجيني ومن ثم المشاركة في تطور مراكز مكافحة الأمراض العصبية5. الأهم من ذلك، تتكون CRCs من مجموعات خلايا مختلفة، بما في ذلك CSCs غير المتمايزة والخلايا السرطانية السائبة التي تظهر بعض الصفات التفاضلية، والتي تشكل بنية هرمية تذكرنا بتنظيم الظهارة في سرداب القولون العادي6،7.
تعتبر CSCs مسؤولة عن ظهور الورم8، والحفاظ عليه ونموه ، وقدرته النقيلية ، ومقاومة العلاجات التقليدية6،7. داخل الأورام، والخلايا السرطانية، بما في ذلك CSCs، عرض مستوى عال من التغايرية والتعقيد من حيث ملامحها الطفرة واللاجينية متميزة، والاختلافات المورفولوجية والظاهرية، والتعبير الجيني، والتمثيل الغذائي، ومعدلات الانتشار، والإمكانات النقيلي9. لذلك ، لفهم أفضل بيولوجيا السرطان ، وتطور الورم ، واكتساب المقاومة للعلاج وترجمته إلى علاجات فعالة ، فإن النماذج قبل السريرية البشرية التي تلتقط عدم التجانس والتسلسل الهرمي للسرطان مهمة10،11.
في المختبر 2D خطوط الخلايا السرطانية قد استخدمت لفترة طويلة وتوفير رؤى قيمة في تطور الورم والآليات الكامنة وراء فعالية الجزيئات العلاجية. ومع ذلك ، فإن تقييدها فيما يتعلق بعدم وجود التغايرية الظاهرية والجينية الموجودة في الأورام الأصلية معترف بها الآن على نطاق واسع12. وعلاوة على ذلك، لا يتم استنساخ المواد الغذائية والأوكسجين، وتدرجات الحموضة، والفيروسات الدقيقة الورم، والبيئة الدقيقة كونها مهمة بشكل خاص للحفاظ على أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك CSCs11،12. للتغلب على هذه العيوب الرئيسية، تم تطوير العديد من النماذج ثلاثية الأبعاد لمعالجة وإعادة إنتاج تعقيد وتغاير السرطانات تجريبيا. في الواقع، هذه النماذج تلخيص الورم التغايرية الخلوية، والتفاعلات الخلية الخلية، والهندسة المعمارية المكانية، مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي12،13،14. الأجهزة السرطانية الأولية التي أنشئت من الأورام الطازجة، فضلا عن كرويدات خط الخلية المشتقة، وتستخدم إلى حد كبير15،16.
يمكن استزراع الكرويات بطريقة خالية من السقالات أو السقالات لإجبار الخلايا على التشكل والنمو في مجاميع الخلايا. تستند الطرق الخالية من السقالات على ثقافة الخلايا في ظل ظروف غير ملتزمة (على سبيل المثال ، طريقة الشنق أو لوحات المرفق المنخفضة للغاية) ، في حين تعتمد النماذج القائمة على السقالات على المواد الحيوية الطبيعية أو الاصطناعية أو الهجينة لخلايا الثقافة12و13و14. السقالة القائمة على كرويدات تقديم مساوئ مختلفة كما تشكيل كروية النهائي سوف تعتمد على طبيعة وتكوين المواد (الحيوية) المستخدمة. على الرغم من أن طرق كروية خالية من السقالة المتاحة حتى الآن لا تعتمد على طبيعة الركيزة ، فإنها تولد كرويدات تختلف في الهيكل والحجم17،18.
كان الهدف من هذا العمل تصميم نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قوي وقابل للاستنساخ من الكرويات ، وهي متجانسة في الحجم ، تتكون من خلايا الكاكو2 الغدية القولونية لدراسة بيولوجيا CSC. خلايا Caco2 ذات أهمية خاصة نظرا لقدرتها على التفريق مع مرور الوقت19،20، مما يشير بقوة إلى إمكانات تشبه الجذعية. وبناء على ذلك، كشفت الثقافة طويلة الأجل للشفرات وجود مجموعات مختلفة من CSC مع استجابات مختلفة للعلاج الكيميائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في المختبر نماذج 3D التغلب على العيوب التجريبية الرئيسية من ثقافات الخلايا السرطانية 2D، كما يبدو أنها أكثر موثوقية في تلخيص الميزات السرطانية النموذجية بما في ذلك البيئة الدقيقة وتغايرية الخلايا. النماذج ثلاثية الأبعاد الشائعة الاستخدام للكرويدات خالية من السقالات (مثقفة في ظروف منخفضة …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بمنصات التصوير ومنصات علم الأنسجة Anipath (CRCL، CLB). نحن مدينون لصيدلية مستشفى سنتر ليون بيرارد (CLB) لهدية من نوع FOLFOX وFOLFIRI. كما نشكر بريجيت مانشيب على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم العمل من قبل FRM (Equipes FRM 2018 و DEQ20181039598) والإنكا (PLBIO19-289). وتلقت مجموعة MVG وLC الدعم من FRM وCF تلقى الدعم من مؤسسة ARC ومركز ليون بيرارد.
Materials
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Recherche en cancérologie. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
