سير عمل شامل من Mass Spectrometry القائم على بروتيوميات بندقية من عينات الأنسجة
Summary
يوفر البروتوكول الموصوف تحليلا كميا محسنا لعينات الأنسجة باستخدام نهجين: الكمية الخالية من التسميات والملصقات. وتستند النهج القائمة على التسمية إلى ميزة كمية أكثر دقة من البروتينات، في حين أن النهج الخالي من الملصقات أكثر فعالية من حيث التكلفة ويستخدم لتحليل مئات العينات من الفوج.
Abstract
وقد أدت التطورات الأخيرة في قياس الطيف الكتلي إلى تحليل بروتيومي عميق إلى جانب توليد مجموعات بيانات قوية وقابلة للاستنساخ. ومع ذلك ، على الرغم من التقدم التقني الكبير ، فإن إعداد العينة من البكبيمنات الحيوية مثل دم المريض ، CSF ، والأنسجة لا يزال يشكل تحديات كبيرة. لتحديد المؤشرات الحيوية، غالبا ما يوفر بروتيوم الأنسجة مصدر عينة جذاب لترجمة نتائج البحث من مقاعد البدلاء إلى العيادة. يمكن أن تكشف عن المؤشرات الحيوية المرشح المحتملة للتشخيص المبكر للسرطان والأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر، ومرض باركنسون، الخ. تنتج بروتينات الأنسجة أيضا ثروة من المعلومات النظامية استنادا إلى وفرة البروتينات وتساعد على معالجة الأسئلة البيولوجية المثيرة للاهتمام.
يمكن تجميع التحليل الكمي للبروتيوميات في فئتين واسعتين: نهج قائم على التسمية ونهج خال من التسميات. في النهج القائم على التسمية، يتم تسمية البروتينات أو الببتيدات باستخدام نظائر مستقرة مثل SILAC (وضع علامات النظائر المستقرة مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا) أو عن طريق العلامات الكيميائية مثل ICAT (علامات التقارب المرمزة بالنظائر)، TMT (علامة الكتلة جنبا إلى جنب) أو iTRAQ (علامة النظائر للكمية النسبية والمطلقة). النهج القائمة على التسمية لديها ميزة كمية أكثر دقة من البروتينات واستخدام تسميات isobaric، يمكن تحليل عينات متعددة في تجربة واحدة. ويوفر النهج الخالي من الملصقات بديلا فعالا من حيث التكلفة للنهج القائمة على الملصقات. يمكن تحليل مئات عينات المرضى المنتمين إلى مجموعة معينة ومقارنتها بالأفواج الأخرى استنادا إلى الميزات السريرية. هنا ، وصفنا سير عمل البروتيوم الكمي الأمثل لعينات الأنسجة باستخدام طرق التنميط البروتيوم الخالية من الملصقات والقائمة على التسمية ، وهو أمر بالغ الأهمية للتطبيقات في علوم الحياة ، وخاصة المشاريع القائمة على اكتشاف العلامات الحيوية.
Introduction
تقنيات البروتيوميات لديها القدرة على تمكين تحديد وتحديد كمي من علامات المرشح المحتملة التي يمكن أن تساعد في الكشف عن المرضوتكهناته 1. وقد عجلت التطورات الأخيرة في مجال قياس الطيف الكتلي البحوث السريرية على مستوى البروتين. يحاول الباحثون التصدي لتحدي علم الأحياء المرضية المعقد للعديد من الأمراض باستخدام البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي ، والتي توفر الآن حساسية متزايدة لتحديد البروتين وتحديد كميته2. قياس دقيق كمي للبروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم التعاون الديناميكي والمكاني بين البروتينات في الأفراد الأصحاء والمرضى3; ومع ذلك ، فإن مثل هذا التحليل على نطاق واسع البروتيوم ليس سهلا.
أحد القيود الرئيسية للتنميط البروتيني للعينات السريرية هو تعقيد العينات البيولوجية. وقد تم التحقيق في العديد من أنواع مختلفة من العينات لدراسة البروتيوم المرض، مثل خطوط الخلايا والبلازما والأنسجة4،5. وتستخدم خطوط الخلايا على نطاق واسع كنماذج في التجارب المختبرية لمحاكاة مراحل مختلفة من تطور المرض. ومع ذلك, أحد القيود الرئيسية مع خطوط الخلية هو أنها تكتسب بسهولة genotypic والتغيرات phenotypic أثناء عملية زراعة الخلايا6. يمكن أن تكون سوائل الجسم مثل البلازما مصدرا جذابا لاكتشاف العلامات الحيوية؛ ومع ذلك ، نظرا للبروتينات وفيرة للغاية ومجموعة ديناميكية من تركيز البروتين ، البلازما بروتيوميات قليلا أكثر تحديا7. هنا، الببتيدات نشأت من البروتينات الأكثر وفرة يمكن قمع تلك المستمدة من البروتينات وفيرة منخفضة حتى لو كانت نسبة الكتلة / تهمة هو نفسه6. على الرغم من أن هناك تقدما في تقنيات الاستنفاد والتفكك في السنوات القليلة الماضية ، والحصول على تغطية جيدة لا يزال قيدا رئيسيا من بروتيوم البلازما8،9. ويفضل استخدام الأنسجة للتحقيق proteomic من بيولوجيا المرض وعينات الأنسجة هي الأكثر قريبة من مواقع المرض وتقديم معلومات فسيولوجية ومرضية عالية لتوفير رؤى أفضل في بيولوجيا المرض10،11.
في هذه المخطوطة، قدمنا بروتوكولا مبسطا لعلم البروتينات الكمي لعينات الأنسجة. لقد استخدمنا عازلة تحتوي على 8 M اليوريا لإعداد الأنسجة lysate كما هذا العازلة متوافقة مع التحقيقات القائمة على قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك ، فإنه إلزامي لتنظيف الببتيدات لإزالة الأملاح قبل حقنها في مطياف الكتلة. نقطة واحدة مهمة أن نتذكر هو تقليل تركيز اليوريا إلى أقل من 1 M قبل إضافة التريبسين لهضم البروتين كما يظهر تريبسين نشاط منخفض في تركيز اليوريا 8 M. لقد شرحنا نهجين من البروتيات العالمية الكمية: القياس الكمي القائم على التسمية باستخدام iTRAQ (علامات إيسوباك للقياس الكمي النسبي والمطلق) والتحديد الكمي الخالي من الملصقات (LFQ). يستخدم البروتيوم الكمي القائم على iTRAQ بشكل رئيسي لمقارنة عينات متعددة تختلف في حالتها البيولوجية (على سبيل المثال ، طبيعي مقابل المرض أو عينات المعالجة). يستخدم هذا النهج الكواشف الإسوباريك لتسمية الأمينات الأولية N-المحطة من الببتيدات12. تحتوي كاشفات iTRAQ على مجموعة مراسل N-methyl piperazine ، ومجموعة موازنة ، ومجموعة إستر N-hydroxy succinimide التي تتفاعل مع الأمينات الأولية N-terminal من الببتيدات13. يتم تسمية الببتيدات المهضومة من كل حالة مع كاشف iTRAQ معين. بعد وضع العلامات ، يتم إيقاف رد الفعل ويتم تجميع الببتيدات المسماة من ظروف مختلفة في أنبوب واحد. يتم تحليل خليط العينة المشترك هذا بواسطة مطياف الكتلة لتحديده وتحديد كمي. بعد تحليل MS / MS ، يتم إنشاء شظايا أيون المراسل ذات الكتل الجزيئية المنخفضة وتستخدم كثافة أيونات المراسل هذه للقياس الكمي للبروتينات.
وثمة نهج آخر، وهو القياس الكمي الخالي من الملصقات، يستخدم لتحديد العدد النسبي للبروتينات في العينات المعقدة دون وضع علامات على الببتيدات ذات النظائر المستقرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتيوم الأنسجة من العينات البيولوجية تمكننا من استكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة الجديدة المرتبطة بمراحل مختلفة من تطور المرض. كما يشرح آلية الإشارات والمسارات المرتبطة بتطور المرض. يوفر البروتوكول الموصوف لتحليل البروتيوم الكمي للأنسجة بيانات تغطية جيدة قابلة للاستنساخ. وقد تم تكيي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بمشروع MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)، #34_IITB المشروع إلى مرفق SS و MASSFIITB في IIT Bombay بدعم من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR13114/INF/22/206/2015) لإجراء جميع التجارب المتعلقة بالتصلب المتعدد.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
