Vi beskriver en modifierad agarbaserad metod utformad för att kvantifiera de svampdödande effekterna av växtbaserade produkter. Både flyktiga och icke-flyktiga bidrag till den svampdödande verksamheten kan bedömas genom detta protokoll. Dessutom kan effekt mot svampar mätas i viktiga utvecklingsstadier i en enda experimentell installation.
Det beskrivna protokollet bygger på en plug-transfer-teknik som möjliggör noggrann bestämning av mikroorganismkvantiteter och deras utvecklingsstadier. Ett angivet antal sporer sprids på en agarplatta. Denna agarplatta inkuberas under en definierad period för att svamparna ska kunna nå det förväntade utvecklingsstadiet, med undantag för sporer där inkubation inte krävs. Agarpluggar täckta av sporer, hyphae eller mycelium dras sedan tillbaka och överförs till agarmedier som innehåller den svampdödande förening som ska testas antingen placerad på avstånd från svamparna eller i kontakt. Denna metod är tillämplig för att testa både flytande extrakt och fasta prover (pulver). Det är särskilt väl lämpat för kvantifiering av de relativa bidragen från flyktiga och icke-flyktiga medel i bioaktiva blandningar och för att bestämma deras effekter, särskilt på sporer, tidig hyphae och mycelium.
Metoden är mycket relevant för karakteriseringen av biokontrollprodukters svampdödande aktivitet, särskilt växtbaserade produkter. När det gäller växtrening kan resultaten användas för att vägleda valet av användningssätt och för att fastställa tröskelvärdena för utlösande ämnen.
Globala förluster av frukt och grönsaker kan nå upp till 50% av produktionen1 och resultera främst från matförfall orsakad av svampförstöring i fält eller under lagringefter skörden 2,3, trots den omfattande sysselsättningen av syntetiska fungicider sedan mitten av 1900-talet4. Användningen av dessa ämnen omprövas eftersom den utgör allvarliga miljö- och hälsorisker. Eftersom de skadliga konsekvenserna av deras användning dyker upp i hela ekosystemen och bevis på potentiella hälsoeffekter har ackumulerats5,6, utvecklas nya alternativ till gamla profylaktiska strategier för behandlingar före och efterskörden 7,8,9. Därför är utmaningen vi står inför dubbel. Nya fungicidstrategier måste för det första bibehålla effektiviteten hos livsmedelsskyddet mot fytopatogener och samtidigt, för det andra, bidra till att dramatiskt minska jordbruksmetoders miljöavtryck. För att uppfylla detta ambitiösa mål föreslås strategier inspirerade av det naturliga försvaret som utvecklats i växter eftersom mer än 1000 växtarter har lyfts fram för sina antimikrobiella egenskaper8. Till exempel är växter som har utvecklat naturliga fungicider för att bekämpa fytopatogener en ny resurs för att utforska utvecklingen av nya biokontrollprodukter2. Eteriska oljor är flaggskeppsmolekyler av denna typ. Till exempel skyddar Origanum eterisk olja tomatplantor mot gråmögel i växthus 10 och Solidago canadensis L. och fatias eteriska oljor har visat sig bevara efterskördade jordgubbar från grå mögelskador11,12. Dessa exempel visar att biokontroll och särskilt växtbaserade produkter utgör en lösning som kombinerar biologisk effektivitet och miljömässig hållbarhet.
Växter är således en viktig resurs för molekyler av potentiellt intresse för växtskyddsindustrin. Endast en handfull vegetabiliska produkter har dock föreslagits användas som biokontrollprodukter trots att de allmänt erkänns som säkra, icke-fytotoxiska och miljövänliga2. Vissa svårigheter i införlivandet från labbet till fältet har observerats, såsom effekt minska när tillämpas in vivo2,9. Således blir det viktigt att förbättra laboratorietesternas förmåga att bättre förutsäga fälteffektiviteten. I detta sammanhang är svampdödande testmetoder för växtbaserade produkter nödvändiga både för att utvärdera deras svampdödande effekt och för att definiera deras optimala användningsvillkor. Specifikt är biokontrollprodukter i allmänhet mindre effektiva än kemiska fungicider, så en bättre förståelse av deras verkningssätt är viktigt för att föreslå lämpliga formuleringar, för att identifiera användningssättet inom fält och för att definiera vilket utvecklingsstadium av patogenen som är sårbart för den sökande bioprodukten.
Nuvarande metoder för antibakteriella och svampdödande aktiviteter inkluderar diffusionsmetoder som agar-diskdiffusion, utspädning, bioautografi och flödescytometri13. De flesta av dessa tekniker, och mer specifikt standardtestning av antifungal känslighet – agar-disk diffusion och utspädningsanalyser – är väl anpassade för att utvärdera den antimikrobiella aktiviteten hos lösliga föreningar på bakteriella och svampsporer i flytande suspensioner14. Dessa metoder är dock i allmänhet inte lämpliga för att testa fasta föreningar såsom torkat växtpulver eller för att kvantifiera svampdödande aktivitet under myceliumtillväxt eftersom de kräver sporutspädning eller sporspridning på agarplattor och/eller utspädning av svampdödande föreningar.13. I den livsmedelsförgiftade metoden vaccineras agarplattor som innehåller det svampdödande medlet med en 5-7 mm diameter skiva som provtas från en 7-dagars gammal svampkultur utan att ta hänsyn till den exakta mängden start av mycelium. Efter inkubation bestäms den svampdödande aktiviteten som en procent av radiell tillväxthämning17,18,19. Med detta tillvägagångssätt kan vi utvärdera den svampdödande aktiviteten på mycelial tillväxt. Däremot utförs agar-utspädningsmetoden för att bestämma den svampdödande aktiviteten på sporer som direkt inokuleras på ytan av agarplattan som innehåller svampdödande föreningar13,20,21. Dessa två metoder ger kompletterande resultat när det gäller svampdödande verksamhet. Dessa är dock två oberoende tekniker som används parallellt och som inte ger korrekt jämförelse sida vid sida av den relativa effekten av svampdödande föreningar på sporer och mycelium17,20,22 eftersom mängden startsvampmaterial skiljer sig åt i de två metoderna. Dessutom är den svampdödande aktiviteten hos en växtbaserad produkt ofta resultatet av kombinationen av svampdödande molekyler syntetiserade av växter för att möta patogener. Dessa molekyler omfattar proteiner, peptider23,24, och metaboliter med bred kemisk mångfald och som tillhör olika klasser av molekyler såsom polyfenoler, terpener, alcaloïds25, glukosinolater8, och organosulfurföreningar26. Vissa av dessa molekyler är flyktiga eller blir flyktiga under patogenattack27. Dessa medel är oftast dåligt vattenlösliga och högtrycksföreningar som måste återvinnas genom vattendestillation som eteriska oljor, av vilka några av vars antimikrobiella verksamhet har varit väl etablerad28. Ångfasmedierade känslighetsanalyser har utvecklats för att mäta den antimikrobiella aktiviteten hos flyktiga föreningar efter avdunstning och migration via ångfasen29. Dessa metoder är baserade på införandet av svampdödande föreningar på avstånd från den mikrobiella kulturen29,30,31,32,33. I den vanliga ångfasen agaranalys deponeras eteriska oljor på en pappersskiva och placeras i mitten av petriskålens lock på avstånd från bakteriell eller svampsporsuspension, som sprids på agarmedium. Diametern på tillväxthämningszonen mäts sedan på samma sätt som för agar-diskdiffusionsmetoden20,24. Andra metoder har utvecklats för att ge kvantitativ mätning av ångfasens antifunktionella känslighet för eteriska oljor, härledda från den buljongutspädningsmetod från vilken en hämmande ångfasmedierad antimikrobiell aktivitet beräknades32, eller härrör från agar-disk diffusionsanalyser31. Dessa metoder är i allmänhet specifika för aktivitetsstudier i ångfas och är inte lämpliga för kontakthämningsanalyser. Detta utesluter bestämning av det relativa bidraget från flyktiga och icke-flyktiga agenser till den svampdödande aktiviteten hos en komplex bioaktiv blandning.
Den kvantitativa metoden vi har utvecklat syftar till att mäta den svampdödande effekten av torkat växtpulver på kontrollerade mängder sporer och odlat mycelium deponerat på ytan av ett agarmedium för att reproducera flygtillväxten av fytopatogener under infektion avväxter 15 samt ett sammankopplat mycelialnät16. Tillvägagångssättet är en modifierad experimentell inställning baserad på agar-utspädning och livsmedelsförgiftade metoder som också möjliggör, i samma experimentella installation, sida vid sida kvantifiering av bidraget från både flyktiga och icke-flyktiga antifungala metaboliter. I denna studie har metoden benchmarkats mot aktiviteten hos tre väl karakteriserade svampdödande preparat.
Det tillvägagångssätt som presenteras här möjliggör utvärdering av svampdödande egenskaper hos minimalt bearbetade växtbaserade produkter. I detta protokoll uppnås homogen fördelning av sporer på agarytan med hjälp av 2 mm glaspärlor. Detta steg kräver hanteringsförmåga för att korrekt fördela pärlorna och få reproducerbara resultat, vilket i slutändan gör det möjligt att jämföra svampdödande effekter i olika stadier av svamptillväxt. Vi fann att 5 mm glaspärlor eller överdriven rotation und…
The authors have nothing to disclose.
Vi är mycket tacksamma mot Frank Yates för hans värdefulla råd. Detta arbete stöddes av Sup’Biotech.
Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
Distilled water | |||
Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
Garlic powder | Organic shop | ||
Glass beads | CLOUP | 65020 | 2 mm |
Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
Measuring ruler | retail store | ||
Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 – 1000 µL |
Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 – 200 µL |
Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 – 20 µL |
Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
Tooth pick | retail store | ||
Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |