Een niet-coderende kleine RNA MicC draagt bij aan virulentie in buitenmembraaneiwitten in Salmonella enteritidis
Summary
Een λ-Rood-gemedieerd recombinatiesysteem werd gebruikt om een deletiemutant te maken van een kleine niet-coderende RNA-micC.
Abstract
Een niet-coderend klein RNA (sRNA) is een nieuwe factor om genexpressie op post-transcriptioneel niveau te reguleren. Een soort sRNA MicC, bekend in Escherichia coli en Salmonella Typhimurium, zou de expressie van buitenmembraaneiwitten kunnen onderdrukken. Om de regulatiefunctie van micC in Salmonella Enteritidis verder te onderzoeken, kloonden we het micC-gen in de Salmonella Enteritidis-stam 50336 en construeerden vervolgens de mutant 50336Δ micC door het op λ Red gebaseerde recombinatiesysteem en de aangevulde mutant 50336Δ micC / p micC met recombinant plasmide pBR322 die micC tot expressie brengt. qRT-PCR-resultaten toonden aan dat transcriptie van ompD in 50336Δ micC 1,3-voudig hoger was dan die in de wildtype stam, terwijl de transcriptie van ompA en ompC in 50336Δ micC 2,2-voudig en 3-voudig hoger was dan die in de wildtype stam. Deze gaven aan dat micC de expressie van ompA en ompC onderdrukt. In de volgende studie werd de pathogeniciteit van 50336ΔmicC gedetecteerd door zowel 6 weken oude Balb / c-muizen als 1-dag-oude kippen te infecteren. Het resultaat toonde aan dat de LD 50 van de wilde stam 50336, de mutanten 50336Δ micC en 50336ΔmicC/pmicC voor 6 weken oude Balb/c muizen respectievelijk 12,59 CFU, 5,01 CFU en 19,95 CFU waren. De LD 50 van de stammen voor 1-dag-oude kippen waren respectievelijk 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU en2,54 x 10 8 CFU. Het gaf aan dat deletie van micC de virulentie van S verhoogde. Enteritidis bij muizen en kippen door de expressie van buitenmembraaneiwitten te reguleren.
Introduction
Niet-coderende kleine RNA’s (sRNA’s) zijn 40-400 nucleotiden lang, die over het algemeen geen eiwitten coderen, maar onafhankelijk kunnen worden getranscribeerd in bacteriële chromosomen 1,2,3. De meeste sRNA’s zijn gecodeerd in de intergene regio’s (IGR’s) tussen gencoderende regio’s en interageren met doel-mRNA’s door middel van base-pairing acties, en reguleren de expressie van doelgenen op het post-transcriptionele niveau 4,5. Ze spelen een belangrijke regulerende rol in het stofmetabolisme, de synthese van buitenmembraaneiwitten, quorumdetectie en virulentiegenexpressie5.
MicC is een 109-nucleotide klein RNA-transcript aanwezig in Escherichia coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium, dat meerdere buitenmembraaneiwitexpressie zoals OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 en Omp36 6,7,8,9 zou kunnen reguleren. MicC reguleert de expressie van OmpC door ribosoombinding aan de ompC mRNA-leider in vitro te remmen en het vereist de Hfq RNA-chaperonne voor zijn functie in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium legt MicC ompD-mRNA het zwijgen op via een ≤12-bp RNA-duplex binnen de coderende sequentie (codons 23-26) en destabiliseert vervolgens endonucleolytisch mRNA7. Dit regulatieproces wordt ondersteund door chaperonne-eiwit Hfq10. De OmpC is een overvloedig buitenmembraaneiwit waarvan werd gedacht dat het belangrijk was in omgevingen waar de concentraties voedingsstoffen en toxines hoog waren, zoals in de darm6. De OmpD porine is het meest voorkomende buitenmembraaneiwit in Salmonella Typhimurium en vertegenwoordigt ongeveer 1% van het totale celeiwit11. OmpD is betrokken bij de hechting aan menselijke macrofagen en darmepitheelcellen12. MicC onderdrukt ook de expressie van zowel OmpC- als OmpD-porines. Er wordt gedacht dat MicC virulentie kan reguleren. Om nieuwe doelgenen gereguleerd door MicC te onderzoeken en de virulentieregulatiefunctie van micC te bestuderen, kloonden we het micC-gen in de Salmonella Enteritidis (SE) stam 50336 en construeerden vervolgens de mutant 50336ΔmicC en de aangevulde mutant 50336ΔmicC / p micC. Nieuwe doelgenen werden gescreend door qRT-PCR. De virulentie van 50336ΔmicC werd gedetecteerd door muizen en kippeninfecties.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. Enteritidis is een belangrijke facultatieve intracellulaire ziekteverwekker die jonge kippen kan infecteren en symptomen veroorzaakt van enteritis tot systemische infectie en overlijden17,18. Bovendien veroorzaakt S. Enteritidis latente infecties bij volwassen kippen en chronische dragers besmetten pluimveeproducten, wat resulteert in door voedsel overgedragen infecties bij mensen19. Het pathogene mechanisme van S<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Chinese National Science Foundation (nrs. 31972651 en 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), een project gefinancierd door de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).
