Culture 3D d’organoïdes de l’épithélium intestinal des villosités en cours de dédifférenciation

Christina Li; Jeel Shah; Kylee Wrath; Dahlia Matouba; Connor Mills; Kishore Punnath; Ansu Perekatt

doi:10.3791/61809

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Article de méthode

Culture 3D d’organoïdes de l’épithélium intestinal des villosités en cours de dédifférenciation

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DOI :

10.3791/61809

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1 avril 2021

Christina Li¹ , Jeel Shah¹ , Kylee Wrath¹ , Dahlia Matouba¹ , Connor Mills¹ , Kishore Punnath² , Ansu Perekatt¹

¹Department of Biology and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology, ²Department of Pharmacology, Pennsylvania State University College of Medicine

Dans cet article

Résumé

La procédure décrit l’isolement des villosités de l’épithélium intestinal de la souris subissant une dédifférenciation afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde.

Résumé

La clonogénicité des organoïdes de l’épithélium intestinal est attribuée à la présence de cellules souches dans celui-ci. L’épithélium de l’intestin grêle de la souris est compartimenté en cryptes et villosités : la tige et les cellules proliférantes sont confinées dans les cryptes, tandis que l’épithélium des villosités ne contient que des cellules différenciées. Par conséquent, les cryptes intestinales normales, mais pas les villosités, peuvent donner naissance à des organoïdes dans les cultures 3D. La procédure décrite ici ne s’applique qu’à l’épithélium des villosités subissant une dédifférenciation conduisant à la tige. La méthode décrite utilise la souris mutante conditionnelle Smad4-loss-of-function:β-caténine gain-of-function (Smad4^KO:β-caténine^GOF). La mutation provoque la dédifférenciation des villosités intestinales et la génération de cellules souches dans les villosités. Les villosités intestinales subissant une dédifférenciation sont grattées de l’intestin à l’aide de lames de verre, placées dans une passoire de 70 μm et lavées plusieurs fois pour filtrer les cellules lâches ou les cryptes avant le placage dans la matrice BME-R1 afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde. Deux critères principaux ont été utilisés pour s’assurer que les organoïdes résultants ont été développés à partir du compartiment des villosités dédifférenciantes et non à partir des cryptes: 1) évaluer au microscope les villosités isolées pour s’assurer de l’absence de cryptes attachées, avant et après le placage dans la matrice 3D, et 2) surveiller le déroulement du développement organoïde à partir des villosités. L’initiation organoïde à partir des villosités ne se produit que deux à cinq jours après le placage et semble de forme irrégulière, tandis que les organoïdes dérivés de la crypte du même épithélium intestinal sont apparents dans les seize heures suivant le placage et semblent sphériques. La limite de la méthode, cependant, est que le nombre d’organoïdes formés et le temps nécessaire à l’initiation organoïde à partir des villosités varient en fonction du degré de dédifférenciation. Par conséquent, en fonction de la spécificité de la mutation ou de l’insulte à l’origine de la dédifférenciation, le stade optimal auquel les villosités peuvent être prélevées pour déterminer leur potentiel de formation organoïde doit être déterminé empiriquement.

Introduction

Les cryptes intestinales, mais pas les villosités, forment des organoïdes lorsqu’elles sont cultivées dans une matrice de Matrigel ou de BME-R1. Ces organoïdes sont des structures auto-organisatrices, souvent appelées « mini-intestin » en raison de la présence des différentes lignées différenciées, progéniteurs et cellules souches présents dans l’épithélium intestinal in vivo. Le potentiel de formation d’organoïdes à partir de cryptes est attribué à la présence de cellules souches¹. Les villosités intestinales, d’autre part, ne sont constituées que de cellules différenciées et ne peuvent donc pas former d’organoïdes. Cependant, les mut....